Rôle du facteur de transcription SREBP-1c dans l'activation transcriptionnelle des gènes de la glycolyse et de la lipogenèse par l'insuline

et le glucose.

Pour déterminer si le facteur de transcription SREBP-1c est impliqué dans l'activation des gènes de la glycolyse et de la lipogenèse par l'insuline et le glucose, nous avons infecté des hépatocytes en culture primaire avec les adénovirus Ad SREBP-1c DN et Ad SREBP-1c 403 et mesuré l'expression de ces gènes dans différentes conditions d'incubation.

Dans des hépatocytes préincubés en présence d'insuline, l'expression de quantités croissantes de la forme dominante négative de SREBP-1c inhibe proportionnellement l'effet activateur du glucose sur l'expression des gènes FAS, ACC, S14 et L-PK (figure 40). L'effet de SREBP-1c DN sur l'expression des gènes activés par l'insuline et le glucose est spécifique et n'est pas du à un mécanisme d'inhibition général de la transcription. En effet, la triiodothyronine (T3) reste capable d'induire l'expression du gène S14 en présence de SREBP-1c DN (publication 1, fig. 7).

Pour confirmer que SREBP-1c est impliqué dans l'activation des gènes contrôlés par le glucose et l'insuline, nous avons infecté des hépatocytes en culture avec l'adénovirus exprimant la forme dominante positive de SREBP-1c en présence de glucose 25 mM et en absence d'insuline. Dans ces conditions, la surexpression de SREBP-1c 403 induit en fonction du temps une forte augmentation de l'expression des gènes FAS et S14 (figure 41 B).

L'ensemble de ces résultats démontrent que SREBP-1c est le médiateur des effets de l'insuline sur l'expression des gènes FAS et S14.

L'expression des gènes FAS et S14 étant à la fois dépendante de la présence d'insuline et d'une forte concentration en glucose, nous nous sommes intéressés au rôle du glucose dans cette activation. En présence de glucose 5 mM, SREBP-1c 403 induit de façon significative l'expression des gènes FAS et S14. L'addition d'une forte concentration en glucose (25 mM) dans le milieu de culture potentialise l'effet de SREBP-1c 403 sur l'expression de ces deux gènes (figure 42).

Comme dans l'hépatocyte, il a été montré que les gènes de la lipogenèse (ACC, FAS) sont activés par le glucose et l'insuline dans des explants de tissu adipeux blanc (Foufelle et al., 1992). Nous avons donc testé si les mécanismes que nous avons décrit précédemment au niveau hépatique sont également vrais au niveau du tissu adipeux blanc. Dans un premier temps, nous avons testé la

GAPDH ApoAI AGE ß-actine Glucose (mM) pfu /cellule L-PK S14 ACC FAS 5 25 Ad SREBP-1c DN Ad null 30 3 0.3 30 Ad SREBP-1c DN Ad null 5 25 30 3 0.3 30

Figure 40: Effet d'une forme dominante négative de SREBP-1c sur l'expression de gènes impliqués dans la glycolyse et dans la lipogenèse dans des hépatocytes de rats en culture.

Après l'adhérence, les hépatocytes ont été cultivés pendant 16 h en présence de glucose 5 mM, de dexaméthasone 100 nM, de T3 100 nM et d'insuline 100 nM. Les cellules ont ensuite été incubées en présence de glucose 5 ou 25 mM et des mêmes hormones, et soit en absence d'adénovirus ou soit en présence d'adénovirus "vide" (Ad null; 30 pfu/cellule) ou d'Ad SREBP-1c DN (0,3; 3 ou 30 pfu/cellule). Après 24 h, les ARN totaux ont été extraits et l'expression des gènes FAS, ACC, S14, L-PK, AGE, GAPDH, ApoAI et ß-actine ont été mesurés par Northern-blot. Un Northern-blot représentatif de trois expériences est présenté.

FAS S14 25 Ad SREBP-1c 403 (1 pfu/cellule) 4 6 8 10 12 14 16 18 0 heures 18S A B 5 Glucose (mM) 4 6 8 12 0 25 5 Ad null (1 pfu/cellule)

Figure 41: Effet de la forme dominante positive de SREBP-1c en présence de fortes concentrations de glucose sur l'expression des gènes FAS et S14 dans des hépatocytes de rats adultes en culture primaire.

Après l'adhérence, les hépatocytes ont été cultivés pendant 16 h en présence de glucose 5 mM. Les cellules ont ensuite été incubées avec du glucose 25 mM en absence d'insuline et en présence de l'Ad null à 1 pfu/cellule (A) ou de l'Ad SREBP-1c 403 à 1 pfu/cellule (B). Après 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 et 18 h, les ARN totaux ont été extraits et l'expression des gènes FAS et S14 et les ARNr S18 ont été mesurés par Northern-blot. Le Northern-blot présenté est représentatif de trois expériences.

FAS

S14

AGE

-

-

18S

Figure 42: Comparaison des effets de la forme dominante positive de SREBP-1c en présence d'une faible ou d'une forte concentration de glucose sur l'expression des gènes FAS et S14 dans des hépatocytes en culture de rats adultes.

Après l'adhérence, les hépatocytes ont été cultivés pendant 16 h en présence de glucose 5 mM. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 16 h avec du glucose 5 ou 25 mM et en présence ou en absence de l'Ad SREBP-1c 403 (0,3 ou 1 pfu/cellule). Les ARN totaux ont été extraits et l'expression des gènes FAS, S14 et angiotensinogène (AGE) et les ARNr S18 ont été mesurés par Northern-blot. Le Northern-blot présenté est représentatif de trois expériences.

154 sensibilité d'adipocytes isolés issu du tissu adipeux blanc épididymère de rats à l'infection par l'adénovirus en incubant ces cellules avec un adénovirus recombinant exprimant la "green fluorescent protein" (GFP) sous le contrôle du promoteur CMV. Après 24h d'infection, les adipocytes en culture primaire expriment efficacement la protéine GFP, cependant comme montré précédemment (Boizard et al., 1998), des titres d'adénovirus environ 20 fois supérieur (60 pfu/cellule) à ceux utiliser pour infecter les hépatocytes (figure 34) sont nécessaires pour infecter plus de 80 % des adipocytes (figure 43). Nous avons ensuite infecté des adipocytes avec des titres croissants d'Ad SREBP-1c 403, et nous avons mesuré l'expression des gènes FAS et S14 en présence de 5 ou 25 mM glucose. Séparément, une forte concentration en glucose (25 mM) et l'insuline ont un faible effet inducteur sur l'expression des gènes FAS et S14, par contre ensemble ces deux facteurs activent fortement l'expression de ces gènes (figure 44, résultats non publiés). En présence de glucose 5 mM, SREBP-1c 403 induit de manière dose-dépendante l'expression des gènes FAS et S14 (figure 44, résultats non publiés). Le glucose à une concentration de 25 mM potentialise l'effet de SREBP-1c 403 sur ces gènes. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans les hépatocytes.

L'activation des gènes contrôlés par le glucose et l'insuline dans l'hépatocyte nécessite le métabolisme du glucose via la glucokinase (Girard et al., 1997). Nous avons donc vérifié que l'expression de la forme dominante positive et de la forme dominante négative de SREBP-1c n'altérait pas l'activité de la glucokinase en mesurant les concentrations intracellulaires en glucose-6- phosphate en présence d'une faible (5 mM) ou d'une forte (25 mM) concentration de glucose. Nous avons pu montré que l'expression des formes SREBP-1c 403 et SREBP-1c DN ne modifiait pas la capacité de phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate dans des hépatocytes en culture (voir publications 1 et 2), et par conséquent l'effet des deux constructions de SREBP- 1c sur l'expression des gènes de la lipogenèse n'est donc pas dû à des variations de l'activité de la glucokinase.

Pour déterminer si l'inhibition par SREBP-1c DN ou l'activation par SREBP-1c 403 des gènes de la glycolyse et de la lipogenèse a un effet fonctionnel sur la synthèse des lipides à partir du glucose, nous avons surexprimé chacune de ces deux formes de SREBP-1c dans des hépatocytes et visualisé leur effet sur l'accumulation des lipides intracellulaires par coloration au rouge neutre. Nous avons ainsi pu montré qu'en présence d'une forte concentration en glucose l'inactivation fonctionnelle de SREBP-1c abolit

Figure 43: Infection d'adipocytes en culture primaire avec un adénovirus recombinant contenant le gène de la "green fluorescent protein" contrôlé par le promoteur CMV. Après isolement à la collagènase à partir du tissu adipeux épididymère de rats, les adipocytes ont été incubés en présence de glucose 25 mM dans du milieu DMEM contenant 2 % de SVF et infectées avec 60 pfu/cellule d'adénovirus GFP (Green Fluorescent Protein). Après 24 h, les adipocytes ont été observés au microscope à contraste de phase (A) et à fluorescence (B); les cellules infectées par l'adénovirus apparaissent vertes. Les photos montrent un même champs en contraste de phase et en fluorescence (x 400), les flèches indiquent quelques cellules qui n'ont pas été infectées par l'adénovirus.

Figure 44: Effet de la forme dominante positive de SREBP-1c en présence d'une faible ou d'une forte concentration de glucose sur l'expression des gènes FAS et S14 dans des adipocytes en culture primaire de rats adultes.

Après isolement à la collagènase à partir du tissu adipeux épididymère de rats, les adipocytes ont été incubés en présence de glucose 5 ou 25 mM dans du milieu DMEM contenant 2 % de SVF avec ou sans insuline 100 nM et en présence de titres croissants d'Ad SREBP-1c 403 (3, 15 ou 60 pfu/cellule). Après 24 h, les ARN totaux ont été extraits et l'expression des gènes FAS et S14, et les ARNr 18S ont été mesurés par Northern-blot. Le Northern-blot présenté est représentatif de deux expériences.

Insuline - + - - - - + - - - Ad SREBP-1c 403 (pfu/cellule) - - 3 15 60 - - 3 15 60 glucose (mM) 5 25

FAS

S14

18S

totalement l'effet inducteur de l'insuline sur l'accumulation intracellulaire de lipides (publication 1, fig. 8), inversement la surexpression de la forme mature de SREBP-1c mime l'effet de l'insuline sur la synthèse lipidique (publication 2, fig. 8).

En conclusion, SREBP-1c est le médiateur des effets de l'insuline dans l'induction des gènes dépendants de l'insuline et du glucose. Le glucose potentialise l'effet SREBP-1c dans cette activation.

158 V. Effet de SREBP-1c sur l'expression du gène PEPCK

Contrairement aux gènes de la glycolyse et de la lipogenèse, l'expression du gène de la PEPCK est activée par l'AMPc et inhibée par l'insuline. Nous avons donc voulu savoir si SREBP-1c pouvait également être responsable des effets inhibiteurs de l'insuline sur l'expression du gène PEPCK. Nous avons infecté des hépatocytes incubés dans des conditions basales (glucose 5 mM seul) avec l'Ad SREBP-1c 403 et nous avons mesuré en fonction du temps l'expression du gène PEPCK et du gène FAS en contrôle. A t0, l'expression du gène PEPCK est nettement visible alors que l'expression du gène FAS n'est pas détectable (figure 45 A, résultats non publiés). L'expression du gène SREBP-1 403 apparaît entre 4 et 6 h après l'infection et est maximale au bout de 16 h. L'expression du gène FAS est induite entre 6 et 8 h et est maximale après 16 h, inversement l'expression du gène PEPCK diminue entre 6 et 8 h et est complètement inhibée après 14 h (figure 45 A, résultats non publiés). De façon surprenante, l'Ad SREBP-1c DN inhibe également l'expression basale du gène PEPCK tandis qu'un adénovirus "vide" n'a aucun effet (figure 45 B, résultats non publiés).

Nous avons ensuite déterminé si cet effet inhibiteur de SREBP-1c est également vrai lorsque l'expression du gène PEPCK est stimulée par l'AMPc. Après 24 h d'incubation, l'AMPc active fortement l'expression du gène PEPCK dans des hépatocytes en culture (figure 45 B , résultats non publiés). Par contre, lorsque ces cellules sont infectées avec l'Ad SREBP-1c DN, l'effet inducteur de l'AMPc est totalement perdu alors que l'utilisation d'un adénovirus "vide" est sans effet (figure 45 B, résultats non publiés). Nous avons obtenu le même résultat avec l'Ad SREBP-1c 403 (résultats non montrés).

En résumé, SREBP-1c (403 ou DN) est capable de mimer l'effet inhibiteur de l'insuline sur l'expression basale ou stimulée du gène PEPCK.

Figure 45: Effet de la forme dominante positive et de la forme dominante négative de SREBP-1c sur l'expression basale ou stimulée par l'AMPc du gène PEPCK dans des hépatocytes de rats en culture primaire.

(A) Après l'adhérence, les hépatocytes ont été cultivés pendant 16 h en présence glucose 5 mM. Les cellules ont ensuite été incubées en présence de glucose 5 mM et d'Ad SREBP-1c 403 (1 pfu/cellule) pendant 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 h. Les ARN totaux ont été extraits et l'expression des gènes FAS, PEPCK et SREBP-1c 403 a été mesurée par Northern-blot. Le Northern-blot présenté est représentatif de deux expériences. (B) Après l'adhérence, les hépatocytes ont été cultivés pendant 16 h en présence glucose 5 mM. Les cellules ont ensuite été incubées en présence de glucose 5 mM avec ou sans Bt₂-AMPc 100 !M et en absence ou en présence d'Ad null (3 pfu/cellule) ou d'Ad SREBP-1c DN (3 pfu/cellule). Après 24 h, les ARN totaux ont été extraits et l'expression du gène PEPCK et les ARN 18S ont été mesurés par Northern-blot. Le Northern-blot présenté est représentatif de deux expériences.

FAS