Clivage du site-2
2. Acteurs de l'activation protéolytique de SREBP
La sélection et l'analyse de mutants de la lignée cellulaire CHO (Chinese Hamster Ovary) auxotrophes pour le cholestérol ou au contraire échappant au mécanisme de rétrocontrôle négatif par le cholestérol ont permis de cloner les protéases S1P et S2P ainsi qu'une protéine senseur du cholestérol nommée SCAP qui est impliquée dans la régulation protéolytique de SREBP.
a/ La protéine SCAP, un senseur du cholestérol
La protéine régulatrice SCAP (SREBP Cleavage-Activating Protein) a été clonée à partir des cellules 25-RA, une lignée mutante de cellules CHO qui ne réprime pas le clivage de SREBP en présence de cholestérol (Hua et al., 1996b). Dans ces cellules, la synthèse et le captage du cholestérol sont continus même en présence de cholestérol. Ce phénotype cholestérol résistant est dû à une mutation de la protéine SCAP qui stimule en permanence le clivage de SREBP au niveau du site 1, même lorsque les cellules sont chargées en cholestérol (Hua et al., 1996b). SCAP est une protéine transmembranaire de 1276 aa contenant deux domaines. Le domaine NH2-terminal d'environ 730 aa est composé d'une
alternance de séquences hydrophiles et hydrophobes formant huit hélices transmembranaires qui permettent l'ancrage de SCAP dans les membranes du RE (Nohturfft et al., 1998a). Le domaine COOH-terminal contient environ 550 aa et est projeté du côté cytoplasmique. Cette région comporte 5 séquences d'environ 40 aa appelées WD (W, tryptophane; D, acide aspartique) connues pour réaliser des interactions protéine-protéine. Dans la cellule, SCAP forme un étroit complexe avec SREBP. Cette association s'effectue par une interaction entre le
NH2 1 WD 731 1276
SCAP
Y298C 1 Mutant D443N 3 MutantsFigure 25: Structure membranaire de la protéine SCAP.
Le schéma indique la position des deux mutations ponctuelles qui produisent un phénotype cholestérol résistant dans des lignées de cellules CHO mutantes. La région en jaune indique le domaine senseur du cholestérol putatif de la protéine SCAP. Le domaine WD cytosolique correspond à un domaine d’interaction protéine/protéine (Brown et al., 1999).
Cytoplasme
114 domaine régulateur COOH-terminal de SREBP et le domaine WD répétés de SCAP. La formation de ce complexe est nécessaire pour le clivage au niveau du site 1 suggérant que le complexe SCAP/SREBP est le vrai substrat de S1P (Sakai et al., 1997; Sakai et al., 1998a). Le gène SCAP contient 23 exons et 22 introns et a été localisé sur le chromosome 3 (3p21.3) chez l'homme (Nakajima et al., 1999a; Nakajima et al., 1999b).
L'étude de cellules CHO mutantes résistantes à la suppression du clivage de SREBP ont permis de montrer que SCAP est non seulement nécessaire pour la coupure au niveau du site 1 mais est aussi la cible de l'inhibition de ce clivage par le cholestérol. Deux classes de mutants cholestérol résistants ont été décrites, ces deux classes de mutation sont génétiquement dominantes:
- Les mutants de classe 1 produisent une forme tronquée de SREBP-2 contenant le domaine NH2-terminal entier sans le segment d'ancrage
membranaire (Yang et al., 1995; Yang et al., 1994). En conséquence, la protéine SREBP-2 tronquée passe directement dans le noyau sans être protéolysée et ne peut donc plus être inhibée par le cholestérol.
- Les mutants de classe 2 touchent la protéine SCAP. Deux types de mutations ont été identifiées, l'une est présente dans trois lignées mutantes CHO distinctes et provoque le changement d'un résidu acide aspartique en position 443 en asparagine (D443N) (Hua et al., 1996b; Nohturfft et al., 1996), l'autre est aussi une mutation ponctuelle qui provoque le remplacement d'un résidu tyrosine en position 298 en cystéine (Y298C) (Nohturfft et al., 1998b) (figure 25). Quand, l'ADNc SCAP de ces mutants est transfecté dans des cellules sauvages, il abolit la susceptibilité de S1P à être inhibée par le cholestérol, indiquant que l'inhibition de l'activité de S1P par le cholestérol implique une interaction directe ou indirecte avec SCAP. La capacité des mutants SCAP à activer S1P en présence de cholestérol représente un gain de fonction et explique donc l'effet dominant de ces mutations.
Chez des souris transgéniques surexprimant la protéine mutante SCAP (D443N) dans le foie, le contenu nucléaire en SREBP-1 et -2 matures et l'expression des gènes de la synthèse du cholestérol et des acides gras sont augmentés (Korn et al., 1998). Il en résulte que le foie de ces animaux est stéatosé. Quand les souris transgéniques surexprimant SCAP (D443N) sont nourries avec un régime enrichi en cholestérol, le clivage de SREBP-1 et -2 n'est plus inhibé contrairement aux souris sauvages. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus à partir des cellules CHO SCAP mutantes et confirme le rôle senseur du cholestérol de la protéine SCAP.
Figure 26: Comparaison des protéines membranaires contenant un domaine senseur du cholestérol. Les domaines senseur du cholestérol composés de 5 domaines trans- membranaires sont réprésentés en jaune et correspondent aux séquences d’acides aminés (aa) suivantes: SCAP (280 à 446); HMG-CoA réductase (57 à 224); NPC1 (617 à 691) et Patched (420 à 589) (Nohturfft et al., 1998; Brown & Goldstein, 1999). La taille des protéines en acides aminés est indiquée entre paranthèses. Abréviations: SCAP, SREBP Cleavage- Activating Protein de hamster; HMG-CoA réductase, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A réductase de hamster; NPC1, protéine Niemann-Pick type C1 de souris; Patched, protéine Patched de souris. COOH COOH NH2 COOH NH2 NH2 COOH
SCAP
HMG-CoA
Réductase
NPC1
Patched
(1276 aa) (887 aa) (1278 aa) (1434 aa)116 De manière intéressante, les mutations D443N et Y298C sont localisées à l'intérieur d'un segment de 160 acides aminés du domaine membranaire de la protéine SCAP. Ce segment contient 5 des 8 séquences transmembranaires de SCAP et correspond à un domaine senseur du cholestérol. Une séquence similaire a été identifiée dans trois autres protéines qui sont contrôlées par le cholestérol (Brown & Goldstein, 1999) (figure 26). Dans le cas de l'HMG-CoA réductase, cette séquence est responsable de la dégradation de cette enzyme membranaire du RE, quand les cellules sont incubées en présence de cholestérol (Goldstein & Brown, 1990). Un domaine similaire est présent dans la protéine Niemann-Pick type C1, qui est impliquée dans le passage du cholestérol provenant des LDL des lysosomes vers le RE (Loftus et al., 1997). Cette protéine est à l'origine de la maladie génétique de Niemann-Pick qui se manifeste par des anomalies de stockage lipidique au niveau des viscères et du système nerveux central dues à une accumulation du cholestérol provenant des LDL dans les lysosomes. Un domaine senseur du cholestérol a également été identifié dans la protéine membranaire Patched qui est le récepteur de la protéine morphogénique Hedgehog (Tabin & McMahon, 1997).
L'obtention d'une lignée mutante de cellules CHO (lignée SRD-13A) auxotrophe pour le cholestérol a permis de démontrer formellement que la protéine SCAP est essentielle au clivage de SREBP au niveau du site 1 (Rawson et al., 1999). Cette lignée SRD-13A possède deux copies du gène SCAP défectives. Il en résulte que la protéine SCAP n'est pas exprimée et les cellules SRD-13A sont incapables de cliver SREBP au site 1 et sont par conséquent auxotrophes pour le cholestérol. Quand ces cellules sont transfectées avec l'ADNc de la protéine SCAP sauvage, le clivage de SREBP est restauré et l'auxotrophie pour le cholestérol est abolie.
Récemment dans des cellules déplétées en cholestérol, il a été montré que le rôle de SCAP serait de transporter SREBP du réticulum endoplasmique vers le Golgi où est présente la forme active de la protéase S1P responsable du clivage de SREBP au niveau du site 1 (DeBose-Boyd et al., 1999; Nohturfft et al., 1999). En présence de cholestérol, ce transport est bloqué et le clivage de SREBP est aboli.
b/ La protéase S2P
Le gène de la protéase S2P a été cloné par complémentation en transfectant une banque d'ADN génomique humaine dans une lignée mutante
Figure 27: Structure membranaire de la protéase S2P.
La protéase S2P (site-2 protease) est principalement hydrophobe et est incluse dans les membranes du RE. Deux régions hydrophiles remarquables sont indiquées sur le schéma; l’une contient 23 sérines consécutives et l’autre est riche en cystéine (10 résidus cystéine). Les séquences HEIGH et LDG coordonnent un atome de zinc pour former le site actif. Le domaine catalytique est intra-membranaire. (Zelenski et al., 1999).
NH2 COOH
HEIGH LDG
Cytoplasme
Lumière du RE
Région riche en cystéine (259-446) Région riche en sérine
(108-141)
118 de cellules CHO appelée M19 qui est incapable de cliver SREBP au niveau du site 2 (Rawson et al., 1997). Dans les cellules M19, SREBP est clivé au niveau du site 1 mais le domaine NH2-terminal reste ancré dans les membranes en raison de
l'absence de clivage au niveau du site 2. Ces cellules sont par conséquent auxotrophes, elles requièrent pour leur croissance la présence de cholestérol et d'acides gras insaturés dans le milieu de culture. Un réarrangement génomique entraînant la délétion du gène S2P empêche la production des ARNm S2P. La transfection de cellules M19 avec l'ADNc de S2P restaure le clivage de SREBP au niveau du site 2 et abolit l'auxotrophie de ces cellules pour le cholestérol (Rawson et al., 1997). L'ARNm de S2P est présent dans les cellules CHO sauvages et dans tous les organes étudiés.
Le gène humain de la protéase S2P est localisé sur le chromosome X et code pour une protéine de 519 aa extrêmement hydrophobe. La protéine S2P est principalement hydrophobe, mais elle présente cependant deux régions hydrophiles, l'une riche en cystéine et l'autre contenant une série de 23 sérines consécutives (Rawson et al., 1997). La protéine S2P est incluse dans les membranes du RE et les deux régions hydrophiles sont projetées dans la lumière du RE (Zelenski et al., 1999) (figure 27). L'un des segments hydrophobes de S2P contient une séquence HEIGH (acides aminés 171 à 175) caractéristique du site actif des métalloprotéases à zinc (consensus HEXXH). Les deux résidus histidine (H) ainsi qu'un résidu acide aspartique en position 467 coordonnent un atome de zinc (Zelenski et al., 1999). Le remplacement des deux histidines (H) ou de l'acide aspartique ou encore de l'acide glutamique (E) abolit la capacité de l'ADNc S2P à restaurer le clivage de SREBP dans les cellules M19, confirmant que S2P est bien une métalloprotéase (Rawson et al., 1997; Zelenski et al., 1999). La présence du domaine catalytique dans une région hydrophobe de la protéase S2P suggère que ce site actif est localisé à l'intérieur des membranes du RE, dans une position idéale pour cliver sa cible. Ce clivage a lieu entre les résidus leucine et cystéine (LC) de la séquence DRSRILLC (acides aminés 478 à 485) présente dans la première hélice transmembranaire de SREBP (Duncan et al., 1998). Le motif 478-DRSR-481 est indispensable à l'action de S2P (Hua et al., 1996a) ainsi que les résidus asparagine et proline (NP, acides aminés 495 et 496) également présents dans la première hélice transmembranaire de SREBP (Ye et al., 2000). La protéine S2P est la première protéase décrite comme étant capable de cliver une protéine transmembranaire à l'intérieur des membranes, depuis d'autres protéases du même type permettant la libération de facteurs de transcription ont été décrites chez les mammifères et les bactéries (Brown et al., 2000).
c/ La protéase S1P
Le clonage de la protéase S1P a été réalisée en deux étapes. Dans un premier temps, plusieurs lignées de cellules CHO mutantes, dont la lignée SRD- 12B, ont été générées par mutagenèse par rayonnement " et sélectionnées pour leur auxotrophie pour le cholestérol, en raison de leur incapacité à cliver SREBP au niveau du site 1 (Rawson et al., 1998). Dans une seconde étape, les cellules mutantes SRD-12B ont été transfectées avec une banque d'ADNc de cellules CHO sauvages, afin de cloner le gène de S1P par complémentation (Sakai et al., 1998b). Pour cela un système de criblage ingénieux a été mis au point pour détecter les cellules contenant l'ADNc de S1P. Ce système consistait à cotransfecter avec la banque d'ADNc de cellules CHO, un vecteur codant pour une protéine de fusion qui est sécrétée après clivage par S1P. Cette protéine de fusion contenait une phosphatase alcaline liée à la moitié COOH-terminale de SREBP-2, incluant le site 1. Dans des cellules CHO sauvages chargées en cholestérol, cette protéine de fusion reste ancrée dans les membranes du RE. Par contre en absence de cholestérol, cette protéine est clivée par S1P et la partie phosphatase alcaline qui contient une séquence signal, est sécrétée dans le milieu où elle peut facilement être détectée. Ce protocole a permis d'obtenir un ADNc positif codant pour la protéase S1P. La transfection de l'ADNc de S1P dans les cellules SRD-12B restaure la capacité de ces cellules à cliver SREBP-1 et -2 et abolit l'auxotrophie pour le cholestérol. L'ARNm de S1P est produit dans tous les tissus testés mais n'est pas présent dans les cellules SRD-12B (Sakai et al., 1998b).
La protéine S1P de hamster contient 1052 aa et possède 97% d'identité avec la protéine S1P humaine. L'extrémité NH2-terminale comporte une séquence
signal indiquant que cette protéine est transloquée dans la lumière du RE (figure 28). Cette séquence est suivie par un domaine d'environ 290 aa qui identifie S1P comme une protéase à sérine de la famille de la subtilisine. S1P possède la triade catalytique composée des résidus aspartate 218, histidine 249 et sérine 414, classiquement présente dans les protéases à sérine. Le remplacement de chacun de ces résidus rend S1P incapable de complémenter le défaut des cellules SRD-12B, confirmant que S1P est bien une sérine protéase. Le domaine homologue à la subtilisine est suivi d'une séquence d'environ 520 aa et d'une séquence hydrophobe de 25 aa permettant l'ancrage de S1P dans les membranes du RE. La protéine se termine par une séquence de 30 aa extrêmement riche en résidus proline et basiques qui est située du côté cytosolique (Sakai et al., 1998b).