Biol Chem 273, 35299–35306.

178 DISCUSSION

L'utilisation ou la production de glucose par le foie est déterminée par l'état nutritionnel. Les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) et les nutriments (glucose...) contrôlent à court terme par des modifications post- traductionnelles et à long terme au niveau transcriptionnel l'activité des enzymes impliquées dans le métabolisme du glucose. Après un repas riche en glucides, l'insuline et le glucose jouent un rôle essentiel dans l'activation des gènes impliqués dans l'utilisation du glucose (glycolyse, lipogenèse...) et dans l'inhibition des gènes impliqués la production de glucose (gluconéogenèse). Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets géniques de l'insuline et du glucose ne sont que partiellement connus, en particulier aucun facteur de transcription n'a pu être clairement impliqué.

Nous avons montré grâce au modèle d'hépatocytes en culture primaire que la transcription du gène SREBP-1c est contrôlée par l'insuline. En utilisant une forme dominante négative et une forme dominante positive de SREBP-1c, nous avons pu mettre en évidence que ce facteur de transcription est le médiateur de l'insuline dans la régulation transcriptionnelle des gènes du métabolisme glucidolipidique dans le foie. Ces résultats importants pour la compréhension des effets géniques de l'insuline suscitent de nouvelles interrogations quant à la régulation de SREBP-1c et aux mécanismes d'activation transcriptionnelle impliquant ce facteur.

Régulation de l'expression et de l'activité de SREBP-1c par l'insuline dans le foie.

Comment l'insuline conduit-elle à l'activation transcriptionnelle de SREBP-1c ? Nous avons montré que l'activation du gène SREBP-1c par l'insuline est dépendante de la voie de la PI 3-kinase et pas de la voie des MAP kinases (figure 32, résultats non publiés). Si SREBP-1c est le médiateur des effets géniques de l'insuline, l'expression des gènes cibles de SREBP-1c doit également être dépendant de la même voie de transduction de l'insuline. Dans le cas du gène de la glucokinase, nous avons effectivement pu montré que l'activation de ce gène par l'insuline est dépendant de la voie de la PI 3-kinase (figure 32, résultats non publiés). L'activation de la transcription du gène FAS par l'insuline dans des adipocytes 3T3-L1 est également dépendant de la voie de

la PI 3-kinase (Wang & Sul, 1998). De même, l'inhibition transcriptionnelle du gène PEPCK par l'insuline implique la voie de la PI 3-kinase (Sutherland et al., 1995). La PKB/Akt et la P70 S6 kinase sont des effecteurs majeurs de la voie de la PI 3-kinase. Nous avons montré que l'activation du gène SREBP-1c par l'insuline n'implique pas la P70 S6 kinase, comme pour les gènes FAS et PEPCK l'effecteur terminal de la voie de la PI 3-kinase pourrait être la PKB/Akt (Liao et al., 1998; Wang & Sul, 1998). D'autres études sont nécessaires pour déterminer précisément l'effecteur distal de la voie de la PI 3-kinase et sa cible.

Actuellement, les facteurs cis et trans impliqués dans l'activation du promoteur du gène SREBP-1c par l'insuline sont inconnus. Les données issues des souris transgéniques SREBP-1c (Shimano et al., 1997a) ou de la délétion du gène SREBP-1c (Shimano et al., 1999) démontrent que SREBP-1c n'active pas sa propre transcription. De même, nous avons montré que l'expression d'une forme dominante négative de SREBP-1c n'affecte pas l'expression du gène SREBP-1c endogène dans des hépatocytes en culture (publication 1, fig. 6A et publication 2, fig. 5B). Le facteur USF a été impliqué dans l'effet génique de l'insuline sur l'expression du gène FAS (Wang & Sul, 1997). La délétion du facteur USF chez la souris ne modifie pas l'expression du gène SREBP-1c (Casado et al., 1999). L'étude du promoteur du gène SREBP-1c devrait permettre de localiser l'élément de réponse à l'insuline et de déterminer les facteurs de transcription impliqués. Par quels mécanismes l'insuline contrôle-t-elle l'activité de SREBP-1c ?

Nous avons pu démontrer qu'un des mécanismes principaux d'action de l'insuline se situe au niveau transcriptionnel. Cette activation entraîne une augmentation de la forme membranaire (précurseur) et de la forme nucléaire (mature) de SREBP-1c (Shimomura et al., 1999b). Les facteurs qui contrôlent le clivage de la forme précurseur de SREBP-1c sont inconnus. Comme pour SREBP-2, l'ancrage de SREBP-1c dans les membranes du RE présente plusieurs intérêts potentiels: (1) il pourrait permettre de contrôler la concentration de SREBP-1c dans le noyau par clivage protéolytique, (2) il pourrait constituer un pool de réserve de SREBP rapidement mobilisable, (3) il pourrait être un moyen de protection de SREBP contre la dégradation puisque la forme mature de SREBP est rapidement dégradée une fois dans le noyau par une protéase de la famille des calpaïnes (Wang et al., 1994). Ces caractéristiques pourraient permettre à SREBP-1c d'être rapidement disponible pour activer ses gènes cibles après clivage. Cette hypothèse pourrait rendre compte de la rapide activation

180 transcriptionnelle (en moins d'1h) de certains gènes cibles comme la GK ou la FAS après l'absorption d'un repas riche en glucides.

Un certain nombre d'expériences suggère que l'insuline pourrait contrôler le clivage de la forme précurseur de SREBP-1c. Par exemple chez la souris, le jeûne réduit dramatiquement à la fois la forme mature et la forme précurseur de SREBP-1c au niveau du foie. Cependant, la forme précurseur est encore nettement présente entre 9 et 12 h après le début du jeûne alors que la forme mature nucléaire n'est plus détectable entre 3 et 6 h (Horton et al., 1998a). D'autre part, les quantités de SREBP-1c précurseur chez des souris à jeun réalimentées avec un régime hyperglucidique (Horton et al., 1998a) ou chez des souris diabétiques traitées à l'insuline (Shimomura et al., 1999b) sont comparables à celles présentent chez des animaux contrôle nourris ad libitum. Par contre, la forme mature de SREBP-1c est fortement augmentée chez les souris renourries ou traitées à l'insuline. Des souris transgéniques surexprimant la forme mature de SREBP-1c uniquement dans le tissu adipeux (souris aP2- SREBP-1c) présentent une stéatose hépatique due à une forte activité lipogénique associée à une augmentation de la forme mature de SREBP-1c (Shimomura et al., 1999c). Chez ces souris, la quantité de SREBP-1c mature dans le foie est augmentée d'un facteur 4 alors la quantité de SREBP-1c précurseur et l'expression du gène SREBP-1c sont comparables aux contrôles. Les auteurs de ces études suggèrent que chez les souris aP2-SREBP-1c, le clivage de la forme précurseur SREBP-1c et/ou la demie-vie de SREBP-1c mature sont augmentés chez les souris aP2-SREBP-1c (Shimomura et al., 1999c).

L'ensemble de ces observations indique que le clivage de SREBP-1c n'est pas constitutif mais est probablement contrôlé. Contrairement aux isoformes SREBP-2 et -1a, le clivage protéolytique de SREBP-1c est insensible aux concentrations intracellulaires de cholestérol (Hua et al., 1996a). Compte tenu de l'effet de l'insuline et de l'état nutritionnel sur le clivage de la forme mature de SREBP-1c, il est vraisemblable que l'insuline pourrait également agir au niveau du clivage de SREBP-1c. Néanmoins, des résultats obtenus dans notre laboratoire suggèrent que dans l'hépatocyte de rat en culture primaire il n'existe pas contrairement à la souris de dissociation dans les variations de quantités des formes précurseur et mature de SREBP-1c. Dans ce système, les effets rapides de SREBP-1c sur la transcription des gènes cibles ne seraient pas dus à une augmentation de la forme mature de SREBP-1c dans le noyau mais impliqueraient une activation de la forme mature de SREBP-1c déjà présente dans le noyau (Azzout-Marniche et al., 2000).

Il est maintenant bien établi que SREBP-2 active spécifiquement les gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol et que SREBP-1c active spécifiquement les gènes de la biosynthèse des acides gras, alors que SREBP- 1a est capable d'activer les gènes de ces deux voies métaboliques. L'activité des isoformes SREBP-2 et -1a est contrôlée par le cholestérol au niveau de leur maturation protéolytique. Le clivage de la forme précurseur SREBP-2 (et SREBP- 1a) est contrôlé par la protéine SCAP qui forme un complexe avec SREBP-2 au niveau des membranes du RE. En cas de déplétion en cholestérol, SCAP transporte SREBP-2 au niveau du Golgi. Là, le complexe SREBP-2-SCAP est reconnu par la protéase S1P qui clive SREBP-2, puis la forme mature est relarguée après clivage par la protéase S2P pour activer les gènes du métabolisme du cholestérol au niveau du noyau (Brown & Goldstein, 1999; DeBose-Boyd et al., 1999). Dans ce système la régulation par le cholestérol s'exerce directement au niveau de la protéine SCAP et non au niveau de la protéase S1P. Par ailleurs, soulignons que les trois isoformes SREBP-1a, -1c et -2 sont clivées par S1P. Si le clivage de SREBP-1c est contrôlé, ce n'est probablement pas par la protéine SCAP puisque SREBP-1c est insensible au cholestérol. Il faut donc imaginer qu'il existe une autre protéine régulatrice qui permet le transport de SREBP-1c du RE vers le Golgi pour être clivé par S1P. Cette protéine régulatrice pourrait être la cible de l'insuline dans la régulation du clivage de SREBP-1c. Toutefois cette hypothèse est peut-être trop simpliste, en effet chez des souris transgéniques exprimant dans le foie un dominant positif de la protéine SCAP insensible au cholestérol, le clivage de SREBP-2 est constitutif mais également celui de SREBP-1c (Korn et al., 1998). L'invalidation (conditionnelle) de SCAP pourrait donner une indication sur le mécanisme de clivage de SREBP-1c.

L'insuline pourrait également entraîner des modifications covalentes de SREBP-1c comme l'atteste la présence de multiple bandes au niveau de SREBP-1 mature en Western-blot (Wang et al., 1994). In vitro et in vivo, SREBP-1c est un faible transactivateur par comparaison avec les isoformes SREBP-1a et -2 (Pai et al., 1998; Shimano et al., 1997a). Quelques observations suggèrent que la forme mature de SREBP-1c pourrait être activée directement dans le noyau. Par exemple, l'activité transcriptionnelle de SREBP-1c 403 surexprimé dans des cellules Rat1-IR est augmentée en présence d'insuline (Kim et al., 1998). Ainsi, l'insuline par des mécanismes de phosphorylation de la forme mature SREBP-1c pourrait augmenter l'efficacité transcriptionnelle de SREBP-1c en favorisant par exemple son interaction avec d'autres facteurs de transcription. Cette hypothèse a récemment été confirmée dans des lignées cellulaires, en effet la forme mature

gène SREBP-1c Gènes cibles Activation transcription Noyau Cytoplasme Stabilisation ARNm SREBP-1c Modification covalente Stabilisation SREBP-1c ? _{? ?} ? + Signal insuline p Insuline Récepteur à l’insuline p Clivage précurseur SREBP-1c

RE

Figure 46: Mécanismes de régulation établis ou potentiels de l’activité transcriptionnelle de SREBP-1c par l’insuline.

L’activation transcriptionnelle du gène SREBP-1c par l’insuline est claiment établie. D’autres mécanismes de régulation a court terme peuvent néanmoins être envisagés. L’insuline pourrait, comme pour les isoformes SREBP-1a et -2 en cas de déplétion en cholestérol, activer le processus de clivage protéolytique de SREBP-1c permettant la libération et la migration de la partie active vers le noyau. L’insuline pourrait modifier par des mécanismes de phosphorylation l’efficacité transcriptionnelle de la forme mature, cette hypothèse a été vérifiée dans des lignées cellulaires. L’insuline pourrait également augmenter la demie-vie de l’ARNm et/ou protéine SREBP-1c. L’ensemble de ces mécanismes aboutirait à l’activation des gènes cibles de SREBP-1c.

de SREBP-1c est phosphorylée au niveau NH2-terminal via la voie des MAP kinases (Kotzka et al., 1998; Osborne, 1999) et cette modification covalente augmente l'activité transcriptionnelle de SREBP-1c (Kotzka et al., 1998).

Enfin, comme de nombreux gènes du métabolisme énergétique contrôlés par l'insuline, on peut penser que l'insuline pourrait augmenter la demie-vie de l'ARNm SREBP-1c ainsi que celle de la protéine SREBP-1c mature et/ou précurseur. Les différents niveaux de régulation de SREBP-1c par l'insuline établis ou potentiels sont résumés sur la figure 46.

Le facteur SREBP-1c coordonne l'expression des gènes de la glycolyse et de la lipogenèse dans le foie en réponse à l'état nutritionnel et hormonal.

Nos résultats ainsi que de nombreuses observations concernant la régulation et l'activité de SREBP-1c concourent à l'hypothèse que ce facteur de transcription est responsable de l'effet de l'insuline sur l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme glucido-lipidique au niveau du foie. SREBP-1c est fortement exprimé dans les tissus lipogéniques (foie et tissus adipeux). Le profil d'expression de SREBP-1c au cours du développement au niveau hépatique est similaire aux gènes de la lipogenèse: elle est présente pendant la vie foetale (Diomede et al., 1999; Yokoyama et al., 1993), absente au cours de l'allaitement et réapparaît au cours du sevrage (publication 2, fig. 4 et 5A). Chez l'adulte, l'expression du gène SREBP-1c est contrôlée par l'état nutritionnel comme les gènes de la lipogenèse, elle diminue au cours du jeûne et elle est fortement induite par une réalimentation hyperglucidique (figure 30 et Horton et al., 1998a). La surexpression du gène SREBP-1c dans le foie de souris transgéniques active spécifiquement les gènes de la lipogenèse (Shimano et al., 1997a).

L'ensemble de ces caractéristiques font de SREBP-1c un bon candidat pour la régulation du métabolisme glucidique et lipidique dans le foie en réponse à l'état nutritionnel et hormonal. Nous avons démontré que SREBP-1c est le médiateur des effets géniques de l'insuline dans le foie. Plusieurs observations suggèrent que SREBP-1c pourrait être également la cible de plusieurs autres facteurs nutritionnels et hormonaux pour moduler l'expression des gènes du métabolisme glucido-lipidique. Nous avons montré que le glucagon via l'AMPc inhibe la transcription du gène SREBP-1c. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence que l'AMPc est capable d'inhiber l'activité

184 transcriptionnelle de SREBP-1c mature. En effet, l'infection d'hépatocytes en culture avec l'adénovirus Ad SREBP-1c 403 induit l'expression des gènes de la lipogenèse; par contre l'addition d'AMPc dans le milieu abolit cet effet (Foretz, Ferré, Foufelle, résultats non publiés). Un séquence de reconnaissance pour la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) de type -RRXS/T- est présence au niveau du domaine de liaison à l'ADN de SREBP-1c, la phosphorylation de la sérine par la PKA présente au niveau de cette séquence pourrait diminuer l'activité transcriptionnelle de SREBP-1c en altérant sa liaison à l'ADN. Cependant, l'effet de l'AMPc pourrait être indirect via un autre facteur interagissant avec SREBP-1c.

Récemment, il a été montré que la transcription des gènes FAS et L-PK est inhibée par la protéine kinase dépendante de l'AMP (AMPK) qui est activée au cours de stress cellulaires provoquant une déplétion en ATP (Foretz et al., 1998, article présenté en annexe; Leclerc et al., 1998). Dans des expériences préliminaires, nous avons montré que l'activation du gène FAS par la surexpression de la forme SREBP-1c 403 dans des hépatocytes en culture est inhibée par l'addition d'un activateur de l'AMPK suggérant que cette kinase pourrait moduler directement ou indirectement l'activité transcriptionnelle de SREBP-1c (Foretz, Ferré & Foufelle, résultats non publiés).

L'inhibition des gènes de la glycolyse (GK et L-PK) et de la lipogenèse (ACC, FAS, S14...) par les acides gras polyinsaturés décrite dans le foie (Jump et al., 1994) serait également due à une diminution de l'expression et de l'activité de SREBP-1c. En effet in vivo, il a été montré que l'expression du gène SREBP-1c diminue parallèlement à celle des gènes impliqués dans la synthèse des triglycérides à partir du glucose chez des animaux nourris avec un régime hyperglucidique contenant des acides gras polyinsaturés (AGPI) (Kim et al., 1999; Mater et al., 1999; Xu et al., 1999). Chez la souris, Yahagi et al. ont montré que les AGPI inhibent le clivage de la forme précurseur de SREBP-1c dans le foie (Yahagi et al., 1999) (ces résultats sont en faveur d'une régulation du clivage de SREBP-1c). Par contre chez le rat, il semblerait que les AGPI diminuent à la fois les quantités de SREBP-1c mature et précurseur dans le foie (Xu et al., 1999).

L'ensemble de ces observations suggèrent qu'au niveau hépatique, SREBP-1c coordonne l'expression des gènes de la glycolyse et de la lipogenèse par des modification de son expression et de son activité en réponse à des stimuli hormonaux et nutritionnels comme l'insuline, l'AMPc et les acides gras polyinsaturés.

Le facteur SREBP-1c est le médiateur de l'insuline dans l'activation transcriptionnelle du gène de la glucokinase.

La glucokinase est une enzyme clé du métabolisme glucidique hépatique qui catalyse la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate, un substrat au carrefour de différentes voies métaboliques (figure 3). L'importance de cette enzyme est attestée par les dysfonctionnements du métabolisme glucidique observés chez l'animal et chez l'homme lorsque la glucokinase hépatique n'est plus fonctionnelle (Froguel et al., 1993; Postic et al., 1999). Dans le foie, la transcription du gène de la glucokinase est initiée au niveau d'un promoteur hépatique spécifique en aval du promoteur spécifique des cellules ß- pancréatiques (Iynedjian, 1993). La transcription de la glucokinase hépatique est absolument dépendante de la présence d'une insulinémie élevée. Malgré de nombreux travaux, aucun élément de réponse à l'insuline sur le promoteur hépatique n'a pu être mis en évidence par les techniques classiques de transfection ou en utilisant des animaux transgéniques (Iynedjian, 1998; Postic et al., 1995). Toutefois, l'analyse d'un modèle de souris transgénique contenant 83 kb du locus glucokinase de souris centré sur le site d'initiation de la transcription a montré que ce fragment contient toutes les séquences régulatrices nécessaires à l'expression du gène de la glucokinase mais sans pour autant localisé précisément l'élément de réponse à l'insuline (Niswender et al., 1997a). L'implication de SREBP-1c comme facteur de transcription responsable de l'effet de l'insuline devrait aider à identifier cet élément de réponse à l'insuline sur le promoteur du gène de la glucokinase. Nous avons pu montré par transfection transitoire dans des cellules d'hépatocarcinome HepG2 que la forme mature de SREBP-1c est capable de transactiver le promoteur glucokinase en se fixant sur une boîte E consensus localisée entre -87 et -82 pb. Par ailleurs, nous avons montré par mutagenèse dirigée que cette boîte E est cruciale pour l'activité basale du promoteur. Il est intéressant de souligner que cette séquence chevauche un élément de réponse putatif à l'insuline (-83 TGGTTCTTTG -74) décrit précédamment par Parsa et al. (Parsa et al., 1996) et qui est très semblable à l'élément de réponse à l'insuline du gène de la PEPCK (-416 TGGTGTTTTG - 407) (O'Brien et al., 1990). Cependant, l'analyse fonctionnelle de cette séquence par transfection transitoire a montré de cette région est insuffisante pour rendre compte de l'effet transcriptionnel de l'insuline (Parsa et al., 1996). De même, nous n'avons pas observé en transfection transitoire dans des cellules HepG2 d'effet de l'insuline sur le promoteur glucokinase contenant la boîte E. Nous ne pouvons donc pas affirmer que la boîte E en position -87 à -82 est l'élément de

186 réponse à l'insuline sur lequel se fixe SREBP-1c pour traduire les effets géniques de l'insuline. Toutefois, bien que cette région à elle seule ne soit pas capable de reproduire l'effet de l'insuline sur la transcription du gène de la glucokinase, il est possible que d'autres séquences distales capables de fixer des facteurs auxiliaires ou des facteurs tissu-spécifiques et qui interagissent avec le complexe boîte E-SREBP-1c soient nécessaires à l'action de l'insuline. L'étude de nombreux promoteurs contrôlés par SREBP a montré l'importance de la coopération de SREBP avec plusieurs cofacteurs pour leur activation (voir 4ème

partie de l'Introduction).

En ce qui concerne le rôle de SREBP-1c en tant que médiateur transcriptionnel de l'insuline, il est intéressant de noter que chez des souris transgéniques, la surexpression du proto-oncogène c-Myc dans le foie active l'expression de la glucokinase hépatique (Riu et al., 1996; Valera et al., 1995). Cette observation suggère que la surexpression de ce facteur de transcription qui appartient également à la famille des facteurs à domaines b-HLH-LZ mime l'effet de SREBP-1c. Si la surexpression de Myc est capable de reproduire l'action de SREBP-1c en se fixant sur son site, l'élément de réponse à l'insuline devrait probablement être une boîte E comparable à celle que nous avons décrit puisque le facteur Myc se lie uniquement sur ce type de motif. Le facteur USF est également capable de se fixer sur cette boîte E et est capable de transactiver le promoteur glucokinase en transfection transitoire (Iynedjian, 1998). Cependant, il est peu probable que ce facteur soit impliqué dans l'effet de l'insuline car l'invalidation des gènes USF1 et USF2 ne modifie pas la régulation du gène de la glucokinase chez la souris (Vallet et al., 1998; Vallet et al., 1997).

Le facteur SREBP-1c est impliqué dans l'activation transcriptionnelle des gènes dépendants de l'insuline et du glucose.