Les corps nucléaires PML ou PML-NB (parfois retrouvés sous le terme ND10) ont un rôle essentiel dans la régulation de l’alternance latence / réactivation. Ils font l’objet d’une attention très particulière dans la communauté scientifique.
Comme expliqué plus haut, dès son entrée dans le noyau des cellules infectées, l’ADN viral se circularise et se localise au niveau des PML-NB [54], habituellement associés à une répression des séquences géniques situées dans leur environnement [55]. Les PML-NB sont constitués de la protéine PML, mais également de la protéine sp100, des protéines Daxx et ATRX (des protéines chaperonnes impliquées dans l’assemblage des histones 3.3 sur la chromatine) [121].
Au cours de la phase de réplication et en début de réactivation, la protéine ICP0 de HSV-1 induit la transcription du génome viral en activant la dégradation PML-NB (et notamment certains de leurs composants tels que la protéines sp100). A l’inverse, le nombre de PML-NB augmente sous l’effet de l’IFN de type I [54].
L’interaction des PML-NB avec le génome d’HSV-1, les interactions entre ces structures nucléaires, les protéines virales, les IFN ont été décrites beaucoup plus en détail [122-124]. Les mécanismes biologiques cellulaires intimes de ces interactions a en effet constitué la thématique de recherche de l’équipe de Patrick Lomonte (CNRS, Lyon), depuis plusieurs années. Nous avons eu la chance de collaborer à ces travaux, qui se sont notamment appuyés sur le modèle OO développé dans notre équipe. Nous verrons ci-dessous rapidement les résultats des trois dernières études publiées sur le sujet.
Première étude : le positionnement du génome d’HSV-1 et son association avec les PML-NB régule la transcription de LAT en phase de latence
En combinant des approches d’hybridation in situ avec des sondes d’ARN de LAT fluorescents et de microscopie en haute résolution, sur 2 modèles murins (le modèle OO, ainsi qu’un modèle d’infection par scarification cornéenne), Catez et al. ont d’abord décrit deux types de distribution nucléaire des génomes viraux en latence (à J28 p.i.) : présence d’un génome unique (modèle single
latent) ou bien de génomes multiples (multiple latent) (Figure 11) [122].
Figure 11, d’après [122] : Détection in situ du génome de HSV-1 sur des sections de TG de souris infectées à la phase de latence. A) Modèles d’infection latente, oro-oculaire ou par scarification cornéenne. B) Représentation schématique du génome d’HSV-1 et du locus de LAT et des sondes d’hybridation in situ. C) Contrôles d’hybridation in situ sur des souris non infectées. Les pointillés indiquent la position du noyau. D) Les modèles de génome viraux unique (single latent) et multiple (multiple latent) au sein des noyaux. E) proportion des 2 modèles en fonction des modèles murins d’infection utilisés.
L’imagerie cellulaire en microscopie à fluorescence confirmait l’association des génomes viraux aux PML-NB (Figure 12).
Figure 12, d’après [122] : Coupes sur TG de souris à J28 p.i. de l’inoculation labiale. A) Co-localisation en immuno-FISH du génome d’HSV-1 et des protéines PML dans le noyau B) Co-localisation du génome d’HSV- 1 et des centromères.
La reconstruction en 3D des images a permis de déterminer que dans la configuration single
latent, les génomes viraux sont entourés par les protéines répressives PML, mais également Daxx
et ATRX. Dans cette configuration, il n’y a pas (ou très peu) d’expression de LAT. En revanche, dans la configuration multiple latent, la distribution des génomes est plus hétérogène : les génomes viraux sont soit associés aux centromères ou aux PML-NB, soit non associés (Figure 13).
Figure 13, d’après [122] : A) Coupes de TG de souris infectées à la phase latente colorée par immuno-DNA- FISH avec de anticorps anti-ATRX, anti-Daxx et une sonde d’ADN d’HSV-1. Le génome d’HSV-1 est associé aux composants majeurs des PML-NB. B) Analyse en microscopie confocale d’un PML-NB contenant le génome de HSV-1 montrant que l’AND est à l’intérieur du PML-NB (Mesure de la fluorescence en 2D et reconstruction en 3D).
Pendant la phase d’établissement de la latence (entre J6 et J28 p.i.), une augmentation du nombre de PML est observée dans les TG de souris infectées. L’expression des LAT est augmentée dans les noyaux avec génomes multiples, ce qui confortait d’une part l’hétérogénéité de cette
expression, et sa relation avec le nombre de copie de génome viral. Enfin, à l’aide de souris KO pour PML, Catez et al. ont confirmé le rôle des PML et des PML-NBs dans le développement des 2 types de distribution des génomes nucléaires et leur rôle sur l’expression de LAT.
Cette étude montrait donc que des domaines nucléaires impliquant les PML-NBs et les centromères sont impliqués dans le contrôle de la latence, et jouent un rôle clef dans les interactions hôte/virus.
- Seconde étude : L’établissement de la latence est déterminé par les interactions du génome avec l’environnement nucléaire
Dans ce travail, Maroui et al. se sont intéressés plus particulièrement à la phase aigüe, et donc aux phénomènes liés à l’établissement de la latence [124]. Avec des outils similaires, et en utilisant le modèle OO, ils ont montré qu’à la phase aigüe, les génomes viraux ont également 2 types de distribution nucléaire : des compartiments de réplication uniques ou bien des localisations multiples et disséminées dans le nucléoplasme (« multiple acute »), similaires à ceux retrouvés en phase d’infection latente. Dans le type multiple acute, les génomes viraux sont constamment associés à la protéine PML dans des PML-NB contenant de l’ADN viral (nommées vDCP-NB pour viral DNA
containing PML-NB). Afin de déterminer les facteurs viraux et cellulaires favorisant la distribution du
génome associé à la latence, ils ont utilisé des souris sauvages ou KO pour le récepteur de l’IFN de type I, et un virus sauvage ou délété pour ICP4 (une protéine IE considérée comme un transactivateur viral majeur de HSV-1). Ils ont montré que l’incapacité du virus à initier un cycle lytique, combiné à son incapacité à synthétiser ICP0 étaient les 2 facteurs viraux essentiels à la formation des vDCP-NB. De plus, la formation des localisations multiples (multiple acute) est favorisée par la voie de l’IFN de type I. Enfin, l’analyse de TG humains infectés de façon latente a retrouvé une organisation des génomes viraux similaire à celle observée chez la souris, et notamment de la formation de vDCP-NB. Cette étude confortait le rôle majeur des PML-NB dans l’établissement et le contrôle de la latence chez l’homme.
- Troisième étude : Les PML-NB induisent une chromatinisation et donc la latence du génome d’HSV-1 via une interaction avec l’hisone 3.3 et ses protéines chaperonnes
- Dans ce travail, Cohen et al. sont allés encore plus en profondeur dans la mécanistique de cette régulation épigénétique et du rôle des PML-NB [123]. Ils ont utilisé pour cela un modèle in vitro d’infection de fibroblastes dans lesquels HSV-1 ne peut se répliquer. Ils ont montré que les vDCP- NB contiennent les histones H3.3 associés à 2 complexes de protéines chaperonnes de ces histones (le complexe DAXX/ATRX et le complexe HIRA). Ils ont ensuite vérifié qu’HIRA était également associé avec les vDCP-NB in vivo, en l’occurrence dans les neurones des TG de souris infectées à la phase latente. De plus, les vDCP-NB associés aux génomes latents étaient chromatinisés exclusivement avec un H3.3 triméthylé sur K9, indiquant une interaction des chaperonnes de H3.3 avec de multiples loci viraux et un silençage transcriptionnel de HSV-1. Seule une inactivation simultanée des 2 complexes de chaperonne de l’histone 3.3 (le complexe DAXX/ATRX et le complexe HIRA) avait un impact sur la fixation d’H3.3 sur le génome viral. En revanche, la déplétion de PML (étude sur TG infectés de souris PML-/-) impactait directement la chromatinisation du
génome viral avec H3.3. Les auteurs confirmaient par ailleurs que les génomes viraux contenus dans les vDCP-NB ne sont pas définitivement réprimés dans la mesure où la déstabilisation des vDCP-NB par ICP0 permet la reprise d’un cycle réplicatif. Cette étude a donc démontré l’existenc e d’une régulation spécifique de la chromatinisation du génome viral dans les vDCP-NB, dépendante de H3.3, et impliquant ces 2 complexes (DAXX/ATRX et HIRA). Le rôle des PML-NB dans la régulation de l’alternance latence-réactivation passe donc par une chromatinisation du génome d’HSV-1 impliquant l’histone 3.3 et ses chaperonnes.