Résumé en Français
F. Résumé en français
Le facteur d’épissage 1 (splicing factor 1, SF1) a été initialement purifié et reconnu comme étant une protéine résistante à une chaleur de 75-kDa, requise pour l’assemblage précoce du spliceosome. Elle est codée par 14 exons et des ADNc codants différents isoformes de SF1 sont produits par épissage alternatif à partir d’un unique pré-ARNm. Ces isoformes ont été décrits chez l’homme et chez la souris. Ils ont en commun la moitié N-terminale contenant deux séquences signal de localisation nucléaire, un signal d’export nucléaire, un domaine d’interaction avec U2AF65, un domaine KH-QUA2 nécessaire pour la liaison de la protéine sur l’ARN, et un zinc knuckle qui augmente l’affinité de SF1 pour l’ARN. La portion C-terminale des isoformes de SF1 varie pour chaque isoforme, elle contient des régions riches en proline ou en alanine, de différentes longueurs impliquées dans des interactions protéines-protéines.
La fonction de SF1 n’est pas complètement élucidée. De plus, les fonctions respectives des différents isoformes ne sont pas connues pour le moment. La partie N-terminale bien conservée de la protéine est responsable de son activité d’assemblage du pré-spliceosome et plus spécifiquement dans la formation du complex E. Le rôle des différentes parties C-terminales des isoformes de SF1 n’est pas défini. Des études précédentes ont montré que SF1 joue un rôle essentiel pour la viabilité chez S. cerevisiae, C. elegans et dans les cellules de mammifères. Il a été également proposé qu’elle intervient dans la cinétique de l’épissage, dans l’épissage de pré-ARNm avec des sites d’épissage suboptimaux et dans l’épissage alternatif. En dehors de l’épissage, il a été suggéré que SF1 est impliquée dans la régulation de la transcription et la rétention nucléaire des pré-ARNm. Finalement, il a été montré que SF1 se déplace continuellement entre le noyau et le cytoplasme, suggérant une fonction supplémentaire dans le cytoplasme.
Plusieurs isoformes de SF1 sont identifiés à ce jour, mais un certain nombre d’ADNc partiels ont été trouvés dans les actuelles bases de données et n’ont pas été vérifiés.
En outre, l’utilisation alternative de différents sites d’épissage 5’ et 3’ dans la partie 3’
de l’ARNm, combinée avec les excisions d’exons et les rétentions d’introns connus, peut potentiellement donner lieu à plus de 100 ARNm variants. Considérant la possibilité que d'autres sites d'épissage alternatif existent dans la partie N-terminale
de l'ARNm, le nombre d'isoformes possibles pour SF1 augmente de façon spectaculaire.
Dans cette thèse nous avons analysé les isoformes de SF1 au niveau protéique et au niveau de l’ARNm dans différentes lignées cellulaires et différents tissus. À cette fin, l'ARN a été isolé à partir de cellules en culture ou de tissus, inversement transcrits en ADNc, et amplifié par PCR avec des amorces complémentaires à des séquences en 5' et 3' des régions de l'ARNm SF1. Les produits de PCR ont été séquencés afin d'identifier les isoformes présents. Nous avons également analysé l'expression de différentes protéines isoformes par western blot provenant d'extraits préparés à partir de différents tissus. Les résultats présentés ici montrent que la partie N-terminale de SF1 est commune à tous les isoformes. Un événement d'épissage alternatif a toutefois été observé, qui a déjà été démontré chez la Drosophile et qui produit un transcript sans l'exon 3 et portant un codon stop prémature. Nos résultats montrent que cet isoforme est probablement dégradé par le processus de nonsense mediated mRNA decay (NMD). À la partie C-terminale aucun nouvel isoforme n'a été identifié. Nos résultats mettent en évidence que les isoformes de SF1 sont exprimés dans chaque tissu de manière spécifique.
Le rôle de SF1 dans la cellule n'est pas totalement déterminé et la présence d'un nombre relativement élevé d'isoformes complique l'étude de sa fonction. Dans cette thèse, nous avons essayé de comprendre le rôle de SF1 dans le noyau cellulaire en utilisant le procédé d’immunofluorescence. Nous avons examiné la localisation cellulaire et la dynamique de chaque isoforme afin de comprendre la fonction de SF1 en termes de distribution subnucléaire et d'interaction avec des molécules différentes.
La relation ainsi que l’ interaction de SF1 avec les ARNncs (ARN non codant) ont également été examinées, toujours dans le contexte de sa localisation nucléaire.
Les résultats présentés ici montrent que SF1 est localisée dans les taches nucléaires,
“speckles”, comme les autres facteurs d'épissage, et qu’elle est un nouveau composant de “paraspeckles”, structures qui se trouvent autour de ‘’speckles’’. De plus, SF1 partage de nombreuses caractéristiques avec d’autres protéines des
“paraspeckles”. La fonction des paraspeckles n'est pas connue, mais le contenu en protéines de ceux-ci (PSP1, PSP2, p54nrb, PSF, CFIm68) oriente celle-ci vers un rôle dans le contrôle transcriptionnel et dans le métabolisme de l'ARN. Les données préliminaires de cette étude suggèrent fortement que les paraspeckles ne sont pas
impliqués dans l'épissage. Un rôle de ces structures subnucléaires dans le maintien d'un ARN non-codant (ARNnc) libéré après un stress, a été signalé précédemment.
Un lien entre paraspeckles et stress est également implicite dans nos données actuelles. En outre, il a été démontré précédemment que SF1 se lie à un certain nombre de ARNncs par des expériences in vivo de “cross-linking”. Il a été aussi signalé que, à la fois les speckles et les paraspeckles contenaient des ARNncs. Nos résultats étayent les conclusions précédentes et montrent que trois ARNncs, Malat-1, Men-ε et Men-β, sont présents dans les paraspeckles et au moins deux d'entre eux, Men-ε et Men-β, se trouvent associés à SF1.
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