Ce chapitre comporte des résultats préliminaires qui ont été obtenus récemment ou qui n’ont pas été répétés suffisamment pour en tirer des conclusions définitives, mais qui ouvrent tout de même sur des pistes intéressantes. Il s’agit de résultats portant sur le niveau d’expression à la membrane de KCC4, KCC4(T926A), KCC4(T980A) et KCC4(T926A/T980A), sur l’oligomérisation de KCC4 en présence ou non de WNK4, sur la nature de l’interaction entre KCC4 et WNK4 ainsi que sur le niveau de phosphorylation de KCC4 en présence ou non de WNK4 et de calyculine A.
5.1 La présence des mutations T926A et T980A sur KCC4 ne modifie pas l’expression à
la membrane du transporteur
Pour vérifier que la modification de l’activité des mutants KCC4(T926A) et KCC4(T926A/T980A) comparativement à celle de KCC4 n’était pas causée par une modification de l’expression à la membrane du transporteur, des études de biotinylation de surface ont été réalisées. La figure 5-1 montre l’expression à la membrane de KCC4, de KCC4(T926A), de KCC4(T980A) et de KCC4(T926A/T980A). On peut voir que les trois protéines mutantes sont exprimées de manière similaire au KCC4 de type sauvage.
Figure 5-1 Expression de surface de KCC4, KCC4(T926A), KCC4(T980A) et
KCC4(T926A/T980A). Des ovocytes exprimant KCC4-HA, KCC4(T926A)-HA, KCC4(T980A)-HA ou KCC4(T926A/T980A)-HA ont été incubés dans le milieu 5 ; 125 après quoi les transporteurs KCC4-HA ont été purifiés par biotinylation de surface, séparés par migration sur gel de
polyacrylamide (7,5 %), transférés sur une membrane de PVDF et immunodétectés par chimioluminescence avec un anticorps primaire spécifique (anti-HA) et un anticorps secondaire (anti-mouse-IgG-HRP 1/5000).
5.2 Absence d’interaction directe entre WNK4 et KCC4
Des études de co-immunoprécipitations ont été effectuées pour déterminer si WNK4 pouvait interagir directement avec KCC4. À la figure 5-2, on peut voir qu’il y a co- immunoprécipitation entre KCC4-myc et KCC4-HA ainsi qu’entre WNK4-myc et FLAG- WNK4, ce qui montre que les conditions expérimentales sont adéquates. Par contre, il y a absence de co-immunoprécipitation entre KCC4-myc et FLAG-WNK4, ce qui suggère que WNK4 n’interagit pas directement sur KCC4 pour en inhiber l’activité, mais fait plutôt appel à un ou plusieurs intermédiaires incluant probablement PP1.
Figure 5-2 Co-immunoprécipitation entre KCC4 et WNK4. Des ovocytes exprimant plusieurs combinaisons de KCC4 et de WNK4 ont été préincubés dans le milieu 5 ; 125 et les protéines d’intérêts ont été purifiées par une incubation séquentielle avec un anticorps primaire spécifique (anti-myc 1/100 ou anti-FLAG 1/400) et de la protéine G. Les protéines ont ensuite été séparées par migration sur gel de polyacrylamide (7,5 %), transférées sur une membrane de PVDF et immunodétectées par chimioluminescence avec un anticorps primaire spécifique (anti-myc 1/500, anti-FLAG 1/4000 et anti-HA 1/500) et secondaire (anti-mouse-IgG-HRP 1/5000). W, WNK4, K, KCC4.
5.3 Effet de WNK4 sur la capacité de KCC4 à former des oligomères
Il est maintenant connu que KCC4 peut s’associer en oligomères [35], mais les facteurs qui régulent les associations demeurent inconnus. Nous avons voulu vérifier si la présence de WNK4 pouvait modifier la capacité de KCC4 à former de telles structures en réalisant des études de co-immunoprécipitation. La figure 5-3 montre que l’oligomérisation de KCC4 n’est pas modifiée par la présence de WNK4, ce n’est donc pas de cette manière que WNK4 modifie l’activité de KCC4.
Figure 5-3 Co-immunoprécipitation entre KCC4-myc et KCC4-HA en présence ou non de WNK4. Des ovocytes exprimant KCC4-myc et KCC4-HA en présence ou non de FLAG-WNK4, FLAG-WNK4(D318A) ou de FLAG-WNK4(KXVTF1/KXVTF2) ont été incubés en 5 ; 125 et les protéines d’intérêt ont été purifiées par une incubation séquentielle avec un
anticorps primaire spécifique (anti-myc 1/100, anti-HA 1/100) et de la protéine G. Les protéines ont ensuite été séparées par migration sur gel de polyacrylamide (7,5 %), transférées sur une membrane de PVDF et immunodétectées par chimioluminescence avec un anticorps primaire spécifique (anti-myc 1/500 et anti-HA 1/500) et un anticorps secondaire (anti-mouse-IgG-HRP 1/5000). A) Résultats obtenus suite à l’immunoprécipitation de KCC4-myc et la détection de KCC4-HA avec un Western représentatif. B) Résultats obtenus suite à l’immunoprécipitation de KCC4-HA et la détection de KCC4-myc avec un Western représentatif. Les résultats sont exprimés comme des différences dans la densité des bandes relativement à KCC4-myc ou KCC4-HA seul (n = 3-4). Aucune valeur n’est statistiquement différente de 1,0.
Chapitre 6 : DISCUSSION, CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 6.1 Discussion
Grâce à nos travaux, nous avons montré pour la première fois que WNK4 et PP1 font toutes deux partie d’une voie de signalisation commune qui est impliquée dans l’activation de KCC4 par le volume cellulaire. Cette activation de KCC4 par l’augmentation du volume cellulaire se ferait soit par une diminution de l’activité endogène de WNK4 ou par une augmentation de celle de PP1. De plus, la kinase semble agir en amont de PP1 contrairement à ce qui a été suggéré dans une étude antérieure [95]. Nous avons aussi identifié une région dans le C-terminus de KCC4 qui soutient l’effet de WNK4 et de PP1. À des fins de justification et d’explication, chacune de ces prémisses sera détaillée et discutée plus en détail dans les prochains paragraphes. Par ailleurs, une réflexion sur le choix du modèle expérimental sera préalablement présentée.
6.1.1 Choix du modèle expérimental
Le système d’expression des ovocytes de Xenopus laevis a été privilégié dans ce travail pour plusieurs raisons : les ovocytes sont faciles d’utilisation, ils sont visibles à l’œil nu (environ 1 mm de diamètre), ils peuvent être gardés vivants plusieurs jours dans un milieu adapté, ils expriment les protéines d’intérêt à des niveaux généralement élevés [117] et, du fait qu’ils sont pluripotents, ils sont capables de traduire des ARN provenant de plusieurs organismes et d’effectuer les modifications post-traductionnelles des protéines correctement [118, 119]. D’un point de vue plus spécifique au projet de cette thèse, il a été montré que les ovocytes exprimaient de manière endogène plusieurs intermédiaires signalétiques potentiellement impliqués dans la régulation des KCC, tel que la PP1 [120], la PP2A [121] et plusieurs protéines kinases [122]. Finalement, ce type de cellule exprime un faible niveau de transporteurs endogènes de K+, ce qui nous permet d’avoir un bruit de fond faible provenant principalement de la pompe Na-K-ATPase et de NKCC1, lesquels sont facilement inhibés par la ouabaïne et le furosémide, respectivement.
6.1.2 L’hypotonicité diminue l’activité endogène de WNK4 ou augmente l’activité celle de PP1
L’augmentation du volume cellulaire est connue comme pouvant engendrer une multitude de modifications à l’intérieur de la cellule. Ces modifications peuvent être transcriptionnelles [123-125], traductionnelles [126, 127] ou post-traductionnelles [59, 60].
En ce qui a trait à la régulation transcriptionnelle, il existe dans la région régulatrice de certains gènes des éléments sensibles au volume cellulaire tel que : des éléments de réponse à l’osmolalité (ORE) et des éléments de réponse à la tonicité (TonE) [123]. Ces éléments sont entre autres présents sur AQP-2 [124] et SGK1, [125] deux joueurs importants dans la régulation du volume cellulaire.
La régulation traductionnelle, quant à elle, joue un rôle moins important (ou moins bien connu) dans le contrôle du volume cellulaire. Elle impliquerait la voie mTOR qui fait appel à plusieurs protéines, dont mTORC1. Celle-ci aurait la propriété d’activer S6K (1 et 2) qui favorise la traduction et inactive un répresseur de la traduction appelé 4E-BP1 [126]. En outre, une étude a montré que la traduction de KCC2 pouvait être augmentée par la rapamicine, un inhibiteur de mTORC1 [127].
La régulation post-traductionnelle est la plus courante et la plus rapide. Les modifications qu’elle engendre sont de nature multiple. Par ailleurs, ces modifications impliquent souvent plusieurs intermédiaires signalétiques dont certains sont sensibles à l’osmolalité, tels que les WNK [81, 82, 90]. Elles peuvent inclure l’ajout ou le retrait de groupements chimiques comme c’est le cas pour les KCC qui seraient déphosphorylés et activés lorsque le volume cellulaire est augmenté, ce qui en font des éléments clés dans le RVD [60]. Cette régulation peut aussi inclure la modification de la localisation cellulaire de la protéine cible. Par exemple, pour WNK1 et WNK4, la diminution du volume cellulaire favoriserait leur relocalisation du cytosol vers le trans-Golgi [81, 82]. Finalement, cette régulation peut aussi inclure la modification de sa maturation ou de sa dégradation. Par exemple, il a été montré que WNK4 augmentait la dégradation du NCC par le lysosome [103].
La régulation des WNK durant les changements de volume cellulaire semble s’effectuer aux étapes transcriptionnelles et post-traductionnelles de la synthèse protéique. Pour L-WNK1, par exemple, la diminution du volume cellulaire induit par le sorbitol augmente l’activité kinase de L-WNK1 par autophosphorylation et une redistribution de L- WNK1 du cytosol vers les endosomes de recyclage au trans-Golgi [81]. Pour WNK4, les études à ce sujet sont moins nombreuses. Il y aurait des changements analogues durant le rétrécissement cellulaire [82] en plus d’une diminution de l’expression de la kinase reliée à la présence d’éléments de réponse aux glucocorticoïdes, une famille d’hormone impliquée dans la régulation du volume cellulaire [128].
Il est possible que l’activité de la PP1 soit aussi modifiée par les changements de volume cellulaire via les sous-unités régulatrices de l’enzyme. Ces dernières sont responsables de la spécificité de la sous-unité catalytique pour les substrats et de l’adressage de l’enzyme dans des compartiments cellulaires données [129]. Les sous-unités régulatrices sont très diversifiées; on en retrouve plus de 100 chez les eucaryotes [130]. Elles peuvent être modulées par plusieurs effecteurs tels que l’adrénaline [131], l’insuline [132] et la concentration intracellulaire de NaCl. Par exemple, l’association de la sous-unité régulatrice PTG (Ppp1r3c) à PP1 est inhibée par une augmentation de la concentration intracellulaire du NaCl ou de l’osmolalité, menant à la phosphorylation de NFAT5/TonEBP et à une augmentation de son activité [133].
Selon nos résultats actuels, l’effet de WNK4 et de la calyculine A dans les ovocytes est de diminuer le cotransport des ions par KCC4 en condition hypotonique. Ceci suggère que l’inhibition du transport est causée soit par une diminution de l’activité de WNK4 endogène ou par une augmentation de l’activité de PP1 endogène suite à une élévation du volume cellulaire. Même si cette hypothèse n’a pas été testée directement, son bien-fondé réside en partie sur le fait que les activités des WNK [82] et de PP1 [133] peuvent être modulées par les changements de volume cellulaire, et que Xenopus laevis exprime de façon endogène au moins trois isoformes des WNK, WNK1 (gène ID NCBI : 734160), WNK3 (gène ID NCBI : 446227) et WNK4 (gène ID NCBI : 386595), ainsi que la PP1 (gène ID NCBI : 379914).
Dans les travaux de la thèse, nous n’avons pas identifié les mécanismes par lesquels des changements du volume cellulaire affectent l’activité des WNK et de PP1, mais à la lumière des informations présentées précédemment, nous pouvons supposer qu’une diminution du volume cellulaire pourrait produire l’effet inverse, c’est-à-dire une diminution de l’activité de WNK4 ou une augmentation de l’activité de PP1. Cette hypothèse demeure aussi à confirmer à l’heure actuelle.
À noter aussi que l’activité de L-WNK1 est sensible à la variation de la concentration intracellulaire de certains ions. Toutefois, une variation de la concentration intracellulaire des ions se produit aussi lors de l’augmentation ou de la diminution du volume cellulaire, ce qui complique l’interprétation des résultats obtenus dans les études à ce sujet. Par exemple, l’activité de L-WNK1 sur OSR1 est augmentée suite à l’efflux cellulaire de potassium engendré par le RVD, une circonstance où le potassium intracellulaire et le volume cellulaire sont tous deux altérés [134].
6.1.3 WNK4 et PP1 font toutes deux partie d’une voie de signalisation commune Une étude de Lin et al. parue en 2012 a permis l’identification de deux sites de liaisons à PP1 sur WNK4 qui seraient vraisemblablement responsables de l’interaction entre les deux enzymes et permettraient ainsi à PP1 d’agir sur la kinase [95]. Ces sites incluent un motif d’interaction (R/K)(X)(V)X(F/W) qui est aussi présent sur plusieurs autres protéines inhibitrices telles GADD34 (Ppp1r15a) et PTG (Ppp1r3c), deux sous- unités régulatrices de PP1 [135]. Cette séquence n’est pas identique pour toutes les sous- unités régulatrices, mais elle est toujours composée de deux acides aminés hydrophobes qui sont séparés par un acide aminé variable. Même si la valine et la phénylalanine sont les acides aminés les plus importants pour l’interaction avec la sous-unité catalytique, ils peuvent être substitués par l’isoleucine et le tryptophane, respectivement. La séquence consensus est donc Arg/Lys-Arg/Lys-Val/Ile-Xaa-Phe/Trp [136].
Basé sur leurs résultats, Lin et al. ont proposé un modèle selon lequel PP1 permet à WNK4 de maintenir sont effet inhibiteur sur ROMK en déphosphorylant le résidu S1196 et en prévenant ainsi la phosphorylation de ce même résidu par SGK1, ce qui aurait comme effet de diminuer l’activité de WNK4 et donc d’augmenter celle de ROMK. Même s’il est
très intéressant, ce modèle évoque un scénario inhabituel où une protéine avec un motif (R/K)(X)(V)X(F/W) est régulée par PP1 alors que c’est la PP1 qui est normalement régulée par une protéine portant ce motif [130, 135]. Toutefois, cette hypothèse est plausible puisque ce motif est aussi présent sur plusieurs protéines capables de lier PP1, mais qui n’agissent pas à titre de sous-unités régulatrices. D’ailleurs, la liaison d’une protéine sur PP1 via le motif (R/K)(X)(V)X(F/W) n’induit pas de modification de l’activité catalytique de la phosphatase [137].
Au cours de mon doctorat, nous avons étudié le rôle des motifs (R/K)(X)(V)X(F/W) présents à l'intérieur de WNK4 dans la régulation de KCC4. Plus spécifiquement, nous avons observé que ces motifs, dont le rôle supposé était de servir de sites de liaison pour PP1 pour modifier l'activité de la kinase WNK4, permettaient plutôt la régulation de la phosphatase et de KCC4 en aval. Deux observations expliquent pourquoi ce n'est pas en agissant sur WNK4 que PP1 modifierait l'activité de KCC4. D'abord, l’activité de KCC4 en présence de la PP1 endogène et de WNK4(D318A) est inhibée en présence de calyculine A. De fait, si WNK4 jouait son rôle en aval de PP1, la calyculine A aurait dû n’avoir aucun effet, étant donné que la kinase ne possède pas d’activité catalytique et que cette dernière est essentielle pour exercer un effet inhibiteur sur KCC4. Ensuite, l’activité de KCC4 n’a pas été inhibée non plus, ne serait-ce que partiellement, en présence de Wnk4(KXVTF1/KXVTF2), un mutant incapable de lier PP1, mais possédant toujours une activité kinase. Il semblerait donc que l’interaction entre PP1 et WNK4 soit nécessaire pour observer une inhibition de KCC4 par WNK4.
Par ailleurs, une étude de Delpire et al., parue en 2010, montre l’implication de PP1 dans la régulation de NKCC1. Dans cette étude, les auteurs proposent que PP1 inhibe NKCC1 de trois façons. Premièrement, PP1 déphosphorylerait NKCC1 en interagissant directement avec le transporteur via le motif (R/K)(X)(V)X(F/W) présent sur ce dernier. Le second passerait par la déphosphorylation et par l’inactivation de SPAK, un activateur de NKCC1, et le dernier est dit non-définit, car il ne nécessite pas l’activité catalytique de PP1 ni sa liaison avec NKCC1. Il s’agit donc ici d’une étude qui montre l’implication directe de PP1 dans la régulation d’un membre de la famille des CCC. Par contre, pour effectuer leurs études, les auteurs on utilisé le système d’expression des ovocytes de Xenopus laevis dans
lequel ils ont surexprimé non seulement NKCC1, mais aussi la sous-unité catalytique PP1α [138]. Cette approche paraît discutable à première vue puisque ce sont les sous-unités régulatrices qui sont responsables de la spécificité de PP1. Ainsi, l’effet de PP1α sur NKCC1 pourrait être non-spécifique.
Tel que mentionné, l’activation de KCC4 par l’augmentation du volume cellulaire semble impliquer d’autres kinases en plus de WNK4. Même si le but de nos études n’était pas de les identifier toutes, quelques candidates peuvent tout de même être considérées. Entre autres, ces candidates pourraient inclure d'autres membres de la famille des WNK qui possèdent tous la capacité de réguler le cotransport K+-Cl- est sont tous capables d'interagir entres-eux [60, 73, 83, 139]. Une autre candidate potentielle inclurait la PKC-ζ, une kinase atypique [140, 141] insensible à la staurosporine, mais sensible au PMA, puisque que l’activation de KCC4 par le gonflement cellulaire n’est pas affectée par la staurosporine (voir figure 4-5) mais est inhibée par le PMA [59]. D’autres études seront nécessaires pour déterminer à quelle étape de la cascade de régulation pourraient intervenir ces enzymes. Aussi, une étude antérieure de notre laboratoire a montré que l’effet de l’augmentation du volume cellulaire sur KCC4 n’est pas causé par une interaction directe d’une phosphatase sensible à la calyculine A avec le transporteur [59].
De cette même étude antérieure découlent par ailleurs d’autres résultats intéressants concernant la phosphorégulation de KCC4. En premier lieu, les données obtenues ont permis de constater que le système d’expression hétérologue des ovocytes de Xenopus
laevis est un bon modèle pour étudier la phosphorégulation des cotransporteurs cation-Cl-, et ce, grâce à l’utilisation de NKCC1 à titre de contrôle. Effectivement, les modifications du niveau de phosphorylation de NKCC1 suite à des variations de volume cellulaire concordaient avec celles obtenues avec d’autres systèmes d’expressions. Les données ont aussi permis de constater que le niveau de phosphorylation augmentait suite à une diminution du Cl-i, qu’il demeurait inchangé en présence de calyculine A et de PMA, et qui ne diminuait pas suite à une augmentation du volume cellulaire [59].
En ce qui concerne nos résultats, nous avons montré que le niveau de phosphorylation de KCC4 demeurait inchangé en présence de calyculine A, de WNK4, de WNK4 ou de WNK4 . Ceci suggère donc que ni WNK4 ou PP1
n’agissent sur KCC4 en modifiant son niveau de phosphorylation d’ensemble. Une autre hypothèse qui pouvait expliquer comment WNK4 régule KCC4 était que la kinase modifie la capacité de KCC4 à former des homo-oliogomères. Par contre les résultats présentés dans la figure 5-3 montrent que cette hypothèse ne tient pas la route.
6.1.4 Identification de deux résidus importants dans la régulation de KCC4
L'une des trouvailles significatives de cette étude a été l’identification de deux résidus (T926 et T980) sur KCC4 qui participent à l’effet inhibiteur de WNK4 et de la calyculine A sur le transporteur suite à son activation par le gonflement cellulaire. De plus, la mutation de ces résidus en acides aminés non-phosphorylables provoque des modifications majeures dans l’activité du transporteur et dans sa régulation par le volume cellulaire.
Les résidus en question avaient déjà été identifiés par Lifton et al comme étant des sites phosphorégulateurs chez les KCC. Ce groupe a utilisé une méthode qui permet d’obtenir des lysats protéiques enrichis de phosphopeptides, ce qui a conduit à l’identification de deux sites dans KCC3 qui sont déphosphorylés en condition hypotonique. Il s’agit des résidus T991 et T1048 qui sont homologues aux résidus T926 et T980 chez KCC4. Par la suite, des études de mutagénèses ont montré que le résidu T991 était la cible principale des phosphatases inhibées par la calyculine A et que les résidus T991 et T1048 étaient les seuls sites phosphorégulateurs présents dans la protéine. Effectivement, le double mutant en condition isotonique ne présentait pas une activité supérieure à celle observée en condition hypotonique, et des anticorps phosphospécifiques ont permis de montrer que les résidus T926 et T980 pouvaient être déphosphorylés par un mélange de PP1/PP2A [60].
Il est important de rajouter qu’une étude récente de Melo et al. a montré que la S96 présente dans le domaine N-terminal de KCC3 était déphosphorylée en condition hypotonique. Selon cette étude, l’approche utilisée par Lifton et al. ne semble pas avoir permis d’identifier tous les sites régulateurs et leurs conclusions étaient inexactes. En même temps, la mutation du résidu S96 dans l’étude de Melo et al. n’a eu aucun impact sur la fonction du transporteur, laissant supposer que ce résidu ne joue pas un rôle régulateur in
vivo [142]. Par ailleurs, les résidus T926 et T980 ou leurs homologues sont situés dans la partie C-terminale du transporteur, dont l’intégrité est primordiale pour le bon