Résultats méthodologiques de l’étude génétique par AFLP capillaire

IV. Résultats

Marqueur de PM

Marqueur de PM

Marqueur de PM

Marqueur de PM

Echantillon mal digéré Témoin négatif Marqueur de PM

Echantillon bien digéré

Résultats méthodologiques de l’étude génétique par AFLP capillaire

IV. Résultats

2. Résultats de l’approche phylogénique

2.1. Résultats méthodologiques de l’étude génétique par AFLP capillaire

L’AFLP par électrophorèse capillaire a eu lieu au Laboratoire de Botanique Evolutive

de Neuchâtel, avec les précieux conseils du Docteur Yong-Ming YUAN et du Docteur

Roberto GUADAGNUOLO.

2.1.1. Extraction d’ADN

L’AFLP nécessite que l’ADN soit de bonne qualité.

Les élodées prélevées à la fin de l’automne (fin Novembre pour les Vosges du Nord),

puis congelées à - 20 °C pour en extraire l’ADN déb ut Janvier, ont montré une extraction

d’ADN de bonne qualité, ainsi qu’une reproductibilité impressionnante pour toutes les étapes

qui conduisent à l’électrophorèse capillaire, se traduisant par des profils électrophorétiques

fortement similaires entre les feuilles et les racines d’un même individu (95%). Les feuilles

présentant tous les pics des racines plus quelques pics spécifiques. Ces différences

provenant de la présence d’ADN chloroplastique dans les feuilles, puisque l’on travaille sur

l’ADN total de la plante. De plus, les profils électrophorétiques entre deux apex foliaires d’un

même individu ont montré une parfaite similarité (100%).

Par contre, les élodées prélevées fin Mai (Woëvre et Alsace), puis congelées à

- 20 °C pour en extraire l’ADN début Juillet, ont d onné des résultats inexploitables. En effet,

l’ADN des élodées prélevé à cette saison est fortement dégradé par la

congélation/décongélation, comme l’indique la présence des nombreux smirs sur le gel

d’agarose (Figure 15). Cette observation a été vérifiée en comparant l’extraction d’ADN entre

deux fragments d’une même plante, l’un congelé pendant 12 heures, l’autre conservé dans

de l’eau à température ambiante. L’ADN du premier était dégradé, tandis que l’échantillon

frais a permis d’extraire un ADN en parfait état (Figure 16).

Figure 15: ADN dégradé des échantillons Alsaciens dénaturés par la congélation.

Photo d’électrophorèse sur gel d’agarose 0.8%, migration 80V, 10mn.

Figure 16: Comparaison de la qualité de l’ADN, avec et sans congélation du matériel.

Photo d’électrophorèse sur gel d’agarose 0.8%, migration 80V, 20mn.

Cette expérience nous montre que les plants d’élodées ne supportent pas la

congélation/décongélation en période de croissance. L’extraction devant alors être réalisée

rapidement sur du matériel frais. Ainsi, nous pouvons dire que cette technique est fiable, à

condition d’avoir un ADN de bonne qualité (Figure 17).

Figure 17: Exemple de vérification d’une extraction d’ADN sur du matériel frais.

Photo d’électrophorèse sur gel d’agarose 0.8%, migration 80V, 20mn.

1000pB

A B

1000pB

légende :

A: DNA extrait de

matériel congelé 12

heures

B: DNA extrait du même

matériel mais frais

2.1.2. Digestion de l’ADN

Une fois que nous sommes en possession d’un ADN de qualité, cet ADN est digéré

par les deux enzymes de restrictions, EcoRI et Tru9I.

Sur un gel d’agarose, nous avons vérifié la qualité de la digestion (Figure 18):

Pour les échantillons complètement digérés, on ne voit plus que de légers smirs,

correspondant à un ADN coupé en de nombreux fragments de tailles différentes.

Pour les échantillons mal digérés, une forte bande de haut poids moléculaire est encore

visible, il faut alors refaire la digestion pour ces échantillons.

Figure 18: Exemple de la digestion de l’ADN.

Photo d’électrophorèse sur gel d’agarose 0.8 %, migration 80V, 20mn

2.1.3. Amplification présélective

L’ADN étant digéré puis ligué, nous pouvons alors augmenter le pool des fragments

digérés par une amplification présélective, qui utilise comme amorce les oligo-nucléotides

ligués à l’étape précédante, plus une base qui appartient spécifiquement à l’ADN digéré de

la plante. Sur un gel d’agarose, nous avons vérifié la qualité de cette amplification

présélective, qui est aussi le témoin du bon déroulement de la ligation (Figure 19). Alors que

pour la digestion, l’ADN n’est visible que sous forme de smirs, représentants toute une

gamme de tailles de fragments, nous pouvons observer cette fois-ci l’amplification de

certains de ces fragments sélectionnés. Les profils semblent relativement similaires entre

tous les échantillons.

Figure 19: photo de la migration par électrophorèse sur un gel d’agarose (1.5%)

des produits issus de l’amplification préselective

100 pb

100 pB

2.1.4. Amplification sélective

La vérification d’une bonne amplification sélective ayant été faite, nous amplifions nos

échantillons, cette fois-ci de façon plus sélective. La séquence de l’adaptateur est utilisée

comme amorce, de chaque coté du fragment, plus trois bases spécifiques de la séquence

ADN de la plante. La première de ces trois bases est celle qui a été utilisée pour

l’amplification présélective. Les deux varient selon les couples de primer utilisés.

L’amplification sélective est l’étape décisive. Elle met en évidence les problèmes qui

auraient pu intervenir pendant les manipulations précédentes (digestion, ajustement des

concentrations de chaque échantillon à une même valeur, ligation, amplification présélective

et sélective). Quand toutes les étapes précédentes ont bien été réalisées, nous devons

obtenir entre quarante et cent trente pics d’électrophorèse par échantillon et par couple