Résultats expérimentaux

Trois types d’échantillons ont été étudiés : un échantillon de paroi cel- lulaire de S. pneumoniae, un échantillon de paroi cellulaire en interaction avec CBPE et un échantillon de paroi cellulaire en interaction avec le domaine liant la choline de CBPE. Les spectres obtenus par excitation directe obtenus sur ces trois échantillons sont comparés sur la Figure 3-7. Plusieurs faits inté-

Chapitre 3 : étude des interactions entre les acides téichoïques de Streptococcus pneumoniae et la phos- phorylcholine estérase CBPE

ressants peuvent être observés. Tout d’abord, suite à l’introduction de CBPE ou du CBD de CBPE à l’échantillon de paroi cellulaire, un léger élargissement des raies de résonance du phosphore ainsi qu’une légère variation des dépla- cements chimiques des acides téichoïques (moins de 0,1 ppm) sont constatés, et ce pour tous les pics. Ceci peut être le signe d’une interaction entre les aci- des téichoïques et la protéine. Cependant, ces effets sont similaires pour les deux pics correspondant aux deux phosphorylcholines. Il n’est donc pas possi- ble avec ces informations de déterminer lequel de ces deux sites est le plus im- pliqué dans les interactions paroi cellulaire-protéine.

Figure 3-7. Spectres obtenus par excitation directe des atomes de phosphore sur un spectromètre Bruker 9,4 T équipé d’une sonde double-résonance 4 mm avec ω_Η/2π = 400 MHz et ω_r/2π = 9 kHz sur l’échantillon de paroi cellulaire de S. pneumoniae (en noir), la paroi cellulaire de S. pneumoniae et CBPE entière (en rouge) et la paroi cellulaire de S. pneumoniae et le domaine liant la choline de CBPE (en vert). La température du gaz « bearing » était de 268 K, ce qui cor- respond à une température de 280 K au niveau de l’échantillon. Pendant l’acquisition, du découplage hétéronucléaire CW a été utilisé, avec une puissance de champ rf sur la voie proton de 45 kHz. Le temps d’acquisition était de 200 ms. La puissance de champ rf sur la voie phosphore utilisée lors de l’impulsion à 90° était de 60 kHz. Le nombre de scans accumulés est de 768. Le délai entre deux scans était de 5 s. Une apodisation exponentielle de 5 Hz a été appliquée à la dé- croissance de l’induction libre.

Une autre différence notable est la présence d’un pic supplémentaire vers 3,7 ppm correspondant à la phosphorylcholine libre sur le spectre de paroi cellulaire en interaction avec CBPE entière. Ce résultat confirme l’activité en- zymatique phosphorylcholine estérase de CBPE. Cependant, cette activité ca- talytique étant très lente dans les conditions de l’expérience, il n’a pas été possible de déterminer des paramètres cinétiques. Enfin, l’aire des deux pics correspondant aux phosphorylcholines a diminué environ de la même façon après ajout de la protéine. Encore une fois, il n’a pas été possible de définir laquelle des deux phosphorylcholines est la plus concernée par l’activité cata- lytique de CBPE.

Des mesures de constantes de temps de relaxation longitudinales ont été effectuées par inversion-récupération à la fois sur l’échantillon de paroi cel- lulaire de S. pneumoniae mais aussi sur l’échantillon de paroi cellulaire en in- teraction avec CBPE entière. Une très légère diminution des constantes de temps a été observée pour tous les pics, sans qu’il soit possible encore une fois de faire une distinction entre les deux pics de phosphorylcholines.

Nous avons ensuite souhaité avoir une estimation de l’anisotropie de déplacement chimique des atomes de phosphore portés par les acides téichoï- ques. Pour cela, nous avons enregistré le spectre de la paroi cellulaire de S.

pneumoniae et du domaine liant la choline de CBPE à très basse vitesse de

rotation (105 Hz) (Cf. Figure 3-8). Le spectre observé comporte de nombreu-

ses bandes de rotation sur une plage d’environ 10 ppm, valeur que nous attri- buons donc approximativement à la valeur du CSA des atomes de phosphore.

Il y a alors plusieurs hypothèses. Il serait possible que malgré la pré- sence de la protéine, les acides téichoïques restent très mobiles. Une autre éventualité est la suivante : si les acides téichoïques en interaction avec la pro- téine sont effectivement plus rigides, le CSA de cette partie des acides téichoï- ques est donc plus élevé. L’intensité du pic isotrope doit donc être répartie dans de nombreuses bandes de rotation. Comme la partie des acides téichoï- ques en interactions avec CBPE est plutôt modeste, la sensibilité de ces ban- des de rotation peut donc être trop faible pour que les signaux soient détecta- bles par rapport à la sensibilité des pics isotropes et des bandes de rotation de la partie des acides téichoïques qui n’interagissent pas avec la protéine. Rap-

pelons que selon les simulations montrées en Figure 3-5, la valeur de 10 ppam

ne semble pas optimale pour le transfert PAIN-CP.

Les acides téichoïques étant très mobiles (voir chapitre 2) et donc les interactions dipolaires mettant en jeu ces noyaux étant très moyennées, nous avons essayé de diminuer la température de l’échantillon jusqu’à observation d’un élargissement des raies afin d’augmenter la valeur de ces interactions et donc le transfert 13_C-31_{P. La température a été variée de 298 K à 266 K sans}

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que le spectre ne soit foncièrement modifié. Nous n’avons pas souhaité descen- dre davantage la température de peur d’endommager l’échantillon. Ces expé- riences nous ont cependant permis d’estimer le CSA des atomes de phosphore à environ 10 ppm.

Figure 3-8. Spectre obtenu par excitation directe des atomes de phosphore sur l’échantillon de paroi cellulaire de S. pneumoniae et le domaine liant la choline de CBPE sur un spectromètre Bruker 9,4 T équipé d’une sonde double-résonance 4 mm avec ωΗ/2π= 400 MHz et ωr/2π= 105 Hz. Les astérisques au-dessus de cer-

tains pics signalent les bandes de rotation. Le spectre a été enregistré à 266 K. Pendant l’acquisition, du découplage hétéronucléaire CW a été utilisé, avec une puissance de champ rf sur la voie proton de 45 kHz. Le temps d’acquisition était de 125 ms. La puissance de champ rf sur la voie phosphore utilisée lors de l’impulsion à 90° était de 80 kHz. Le nombre de scans accumulés est de 256. Le délai entre deux scans est de 3 s. Une apodisation exponentielle de 2 Hz fut ap- pliquée à la décroissance de l’induction libre.

Enfin, lors d’une semaine d’expériences sur la plateforme SON NMR LSF à Utrecht aux Pays-Bas, nous avons pu tester la séquence PAIN-CP avec π-shift sur notre échantillon de paroi cellulaire en interaction avec le domaine liant la choline de CBPE. Les conditions d’expériences sont similaires à celles utilisées lors des simulations : le spectromètre était un Bruker 500 MHz et la vitesse de rotation était de 11 kHz. La température était de 268 K. Grâce aux

cartes de transfert simulées, nous avons choisi les puissances de champs rf à appliquer sur les voies proton, carbone et phosphore afin de créer un méca- nisme TSAR. Ces conditions étaient les suivantes : pC=pP=4,55 et pH=4,15. Malgré tout, aucun transfert 13_C-31_{P n’a pu être observé, même lors d’une ex-} périence 1D où le signal a été accumulé pendant 5 jours.

3.2.5 Conclusion

La détection de transferts à longue distance entre les atomes de phos- phore des acides téichoïques et les atomes de carbone de la protéine CBPE n’a pas été réalisable grâce à la séquence PAIN-CP. Il est possible que la trop grande mobilité des chaînes d’acides téichoïques, ainsi que la faible proportion d’acides impliqués dans les interactions avec la protéine aient rendu cette ex- périence très peu sensible. Il serait peut-être judicieux de mettre en place l’expérience PAIN-CP avec π-shift sur des molécules modèles plus petites. Par exemple, il serait peut être possible d’étudier uniquement les chaînes d’acides téichoïques ou bien des fragments d’acides téichoïques en interactions avec la protéine CBPE ou son domaine CBD. Nous pourrions également envisager de tester l’efficacité des séquences de type TEDOR sur de tels systèmes puis sur la protéine en interaction avec la paroi cellulaire bactérienne. Une autre idée intéressante qui nous a été proposée lors de notre visite à Utrecht est d’étudier nos échantillons grâce à des techniques en détection proton. En effet, comme les acides téichoïques sont assez mobiles, il serait possible d’obtenir des spec- tres de résonance du proton possédant une très bonne résolution. Des techni- ques utilisées couramment en RMN des solutions telles que des expériences NOESY pourraient être utilisées pour détecter des interactions entre les pro- tons des acides téichoïques et ceux de la protéine. Cependant, cette approche nécessite de préparer des échantillons deutérés. Enfin, afin d’augmenter la sen- sibilité de l’expérience, le système entier (paroi cellulaire et protéine) pourrait être étudié par polarisation nucléaire dynamique (ou DNP), lorsque cette technique aura vu sa résolution sensiblement améliorée et que les séquences que nous voulons utiliser auront été validées sur un spectromètre équipé d’un gyrotron.

L’exemple de CBPE démontre bien que la RMN en phase solide a en- core besoin de voir ses méthodes se développer. L’amélioration de la sensibilité des expériences est un premier axe de travail indispensable. Le développement de séquences de recouplage permettant de détecter des contacts à plus longue distance, en plus grand nombre et plus facilement en est un deuxième. Lors de cette thèse, nous avons également travaillé sur ces deux points. Dans un pre-

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mier temps, nous avons mis en évidence un phénomène permettant d’accélérer l’acquisition des spectres ou d’augmenter la sensibilité des expériences. Un au- tre axe de recherche poursuivi pendant ces trois ans repose sur l’amélioration de séquences de recouplage existantes afin de les rendre plus efficaces. Ces études font l’objet des deux parties suivantes.