Préparation et attribution de l’histidine

Dans un premier temps, nous nous somme intéressés à une molécule modèle : l’histidine complètement marquée. Les atomes de cet échantillon pos- sédant des constantes de temps de relaxation très longues, nous avons com- mencé par le doper aux ions Cu(II). Pour cela, la L-histidine uniformément enrichie en carbone 13 et azote 15, achetée chez Cambridge Isotope Laborato- ries, a été recristallisée dans une solution de CuCl2 à 0,9 mM. Après cristalli- sation, un mélange de deux formes cristallines a été obtenu dans des propor- tions différentes. Ces deux formes seront appelées formes A et B de l’histidine dans la suite de ce chapitre. Afin d’attribuer les résonances de ces deux formes cristallines, nous avons enregistré un spectre de résonance du carbone par po- larisation croisée (Cf. Figure 5-1).

Figure 5-1. Spectre 1D de résonance du carbone de l’acide aminé [U-13_C, 15_N]-

histidine. La nomenclature IUPAC a été utilisée pour la numérotation des carbo- nes de la molécule. Les deux formes cristallines présentes dans l’échantillon ont été arbitrairement appelées A et B. Le spectre a été enregistré sur un spectromè- tre Bruker équipé d’une sonde double-résonance 2,5 mm avec ωΗ/2π= 400 MHz

et ωr/2π = 30 kHz. La température au sein de l’échantillon était de 293 K (gaz

« bearing » à 268 K). Le temps d’acquisition était de 45 ms. Le transfert de pola- risation du proton au carbone a été réalisé grâce à une étape de polarisation croi- sée caractérisée par un temps de contact de 1 ms et par une force de champ rf moyen sur la voie proton de 90 kHz et sur la voie carbone de 60 kHz. Une rampe de puissance a été appliquée sur le canal proton 256_{. Pendant l’acquisition, du dé-}

couplage hétéronucléaire de type SPINAL 127 _{a été utilisé, à une force de champ}

rf de 150 kHz. Les impulsions rf sur la voie proton ont été effectuées au même champ. 80 scans ont été accumulés. Le temps entre chaque scan était de 5 s.

Nous avons également enregistré des spectres de corrélation carbone- carbone de type PDSD. Ces expériences nous ont permis de différencier de manière incontestable les systèmes de spins de la forme A et de la forme B (Cf. Figure 5-2). En effet, lors d’une expérience PDSD, l’aimantation initiale- ment acquise par les spins lors de la phase d’excitation est distribuée pendant la période de mélange. A vitesse de rotation à l’angle magique modérée, si le temps de mélange est court, l’aimantation sera distribuée uniquement aux plus proches voisins. En revanche, si le temps de mélange est long, comme dans notre exemple, l’aimantation pourra être distribuée à tous les spins de la molécule, même ceux situés les plus loin. L’aimantation sera cependant beau- coup plus difficilement distribuée à des spins appartenant à une autre molé-

Chapitre 5 : Impact des impulsions sélectives sur le retour à l’équilibre de l’aimantation des carbones en RMN en phase solide

cule, et donc à une molécule possédant une autre forme cristalline, les distan- ces entre les spins devenant trop importantes pour qu’un recouplage efficace ait lieu entre eux. Sur le spectre 2D, le système de spins de la forme A est re- présenté en bleu et celui de la forme B en rouge.

Figure 5-2. Spectre de corrélation carbone-carbone de type PDSD de l’acide ami- né [U-13_C, 15_{N]-histidine. Les pics correspondants à la forme A sont en bleu et}

ceux correspondants à la forme B sont en rouge. Le spectre a été mesuré sur un spectromètre Bruker équipé d’une sonde double-résonance 4 mm avec ωΗ/2π =

400 MHz et ωr/2π= 9 kHz. La température au sein de l’échantillon était de 293

K (gaz « bearing » à 283 K). Le transfert de polarisation du proton au carbone a été réalisé grâce à une étape de polarisation croisée, caractérisée par un temps de contact de 1000 µs, une force de champ rf moyen sur la voie proton de 61 kHz et sur la voie carbone de 52 kHz. Une rampe de puissance a été appliquée sur le ca- nal proton 256_{. Les impulsions rf large bande sur la voie carbone ont été effectuées}

à un champ de 52 kHz également. Pendant l’évolution et l’acquisition, du décou- plage hétéronucléaire de type SPINAL 127 _{a été utilisé, à une force de champ rf de}

90 kHz. Les impulsions rf sur la voie proton ont été effectuées au même champ. Les impulsions rf large bande sur la voie carbone ont été effectuées à un champ de 57 kHz. La fenêtre spectrale était de 30 kHz dans la dimension directe et de 22 kHz dans la dimension indirecte. Le temps de mélange PDSD était de 100 ms. Les temps d’acquisition étaient de 30 ms dans la dimension directe et de 20 ms dans la dimension indirecte. 8 scans ont été accumulés après 4 « dummy » scans. Une détection quadrature de type States-TPPI a été utilisée 128_{. Le temps entre}

deux scans était de 4,8 s, conduisant à un temps expérimental total de 10 h. Une fenêtre d’apodisation de type exponentielle de 0,3 Hz a été appliquée dans la di- mension indirecte.

L’attribution des formes de l’histidine est donnée dans la Table 5-1. L’identification des deux histidines A et B reste encore quelque peu mysté- rieuse. Nous avons proposé que ces deux formes de l’acide aminé obtenues soient deux formes cristallines différentes pendant l’étape de recristallisation, ce qui pourrait expliquer leur proportion différente. Les déplacements chimi- ques que nous avons enregistrés correspondent à ceux référencés par Kimura

et al. pour la forme A 257 _{et Ye et al. pour la forme B} 175_{. Cependant, Piotr} Tekely, lors de la publication de notre article, nous a fait part de son opinion : selon lui, les deux formes de l’histidine que nous observons correspondent à deux formes différemment protonées LH2 (notre forme B) et LH (notre forme A) de l’histidine. Piotr Tekely a appuyé son argumentation sur l’un de ses ar- ticles où il avait étudié les différentes formes acido-basiques de l’histidine 258_. La différence de déplacements chimiques observée entre ceux que nous avons recensés et ceux indiqués dans sa publication pourrait s’expliquer par le carac- tère amorphe de ses échantillons et par le caractère cristallin du nôtre. Ce point de vue est très intéressant et remet en question notre supposition. Nous n’avons pas eu l’occasion de procéder à d’autres expériences afin de détermi- ner la véritable nature de ces formes distinctes de l’histidine, ce qui est regret- table. Cependant, nous ne pensons pas que cela ait un impact sur les interpré- tations de nos données à suivre dans ce chapitre. En effet, le retour de l’aimantation après une impulsion sélective est comparé au retour de l’aimantation après une manipulation large-bande des spins de la même es- pèce.

Déplacements chimiques du carbone 13 / ppm

C=O C2 C4 C5 Cα Cβ

Histidine-A 175,2 135,2 137,2 113,3 57,0 26,5

Histidine-B 172,5 135,9 127,7 118,8 53,9 26,5

Table 5-1. Valeurs expérimentales des déplacements chimiques des résonances du carbone 13 des formes A et B de l’histidine. Les valeurs des déplacements chimi- ques sont calibrées indirectement en utilisant la résonance du carbonyle de la gly- cine référencée à 176,45 ppm par rapport au SDS.

Chapitre 5 : Impact des impulsions sélectives sur le retour à l’équilibre de l’aimantation des carbones en RMN en phase solide

5.1.2 Mesure des constantes de temps de relaxation non-sélectives à basse