Partie I : Etude de la paroi cellulaire bactérienne par
2. Caractérisation de la paroi cellulaire bactérienne et de
2.1 Caractérisation de la paroi cellulaire bactérienne
2.1.2 Caractérisation des acides téichoïques
2.1.2.3 Caractérisation par la RMN du phosphore
Afin de s’assurer que la structure chimique des acides téichoïques n’a pas été altérée lors de la préparation de l’échantillon de paroi cellulaire et d’attribuer les atomes de phosphore des acides téichoïques, des spectres 1D de résonance du phosphore ont été enregistrés à la fois sur les échantillons de pa- roi cellulaire mais aussi sur des échantillons de bactéries vivantes B. subtilis 168 et B. subtilis W23 (Cf. Figure 2-9). Ces spectres ont été obtenus par exci- tation directe, ce pour tous les échantillons de paroi cellulaire. En effet, les acides téichoïques sont trop mobiles pour donner lieu à du signal avec une bonne sensibilité quand une séquence de type CPMAS est utilisée. La RMN du phosphore est une technique de choix pour ce genre d’études car les dépla- cements chimiques du phosphore 31 sont très sensibles à l’environnement chi- mique dans lequel se trouve le noyau, et dans une moindre mesure au pH de l’échantillon et à la force ionique.
La lecture des spectres révèle que les résonances attribuées aux acides téichoïques dans les échantillons de paroi cellulaire peuvent être aussi obser- vées dans les échantillons de bactéries entières, ce à des déplacements chimi- ques pratiquement identiques. Ce résultat montre tout d’abord que la struc- ture chimique des acides téichoïques n’est pas modifiée pendant la préparation de l’échantillon et illustre le fait que les acides téichoïques peuvent être identi- fiés directement chez les bactéries vivantes, malgré la présence de résonances
Chapitre 2 : caractérisation de la paroi cellulaire bactérienne et de ses interactions avec les cations mé- talliques
supplémentaires provenant de l’ADN et/ou de la bicouche lipidique par exem- ple. Les acides téichoïques peuvent être donc directement étudiés par RMN en phase solide à la fois dans des échantillons de paroi cellulaire mais aussi dans des échantillons de bactéries entières. Ces études sont également envisageables grâce au fait que la viabilité des cellules n’est pas affectée par les conditions expérimentales liées à la RMN (rotation à l’angle magique, irradiations rf…). En effet, les bactéries entières sorties des rotors ont pu être cultivées après les expériences RMN sur des plaques agar.
Figure 2-9. Spectres de résonance du phosphore des bactéries à Gram positif vi- vantes et de la paroi cellulaire. A gauche : comparaison des spectres obtenus par excitation directe du phosphore sur les échantillons de cellules vivantes (en rouge) et sur les échantillons de paroi cellulaire isolée (en noir) de (a) B. subtilis 168 et de (b) B. subtilis W23. A droite : spectres obtenus par excitation directe du phosphore de la paroi cellulaire de (c) B. subtilis 168, (d) B. subtilis W23, (e) S. pneumoniae R6 et (f) S. aureus. L’attribution des différents spectres est don- née sur les figures. Les spectres ont été enregistrés comme indiqué sur la Figure 2-7 sauf pour les paramètres décrits ci-dessous. Du découplage hétéronucléaire SPINAL 127 ou CW a été utilisé pendant l’acquisition, à un champ rf de 90 ou 45
kHz, respectivement. Le temps d’acquisition a pu varier de 50 à 120 ms, selon la force du champ rf de découplage. Le temps expérimental était de 1 h et le délai entre deux scans de 5 s.
La comparaison des spectres de résonance du phosphore obtenus sur les échantillons de paroi cellulaire de B. subtilis 168 et W23, S. pneumoniae et S.
aureus permet de souligner le potentiel de la RMN en phase solide pour la ca-
ractérisation des acides téichoïques. En comparant les données précédemment publiées sur les acides lipotéichoïques de S. pneumoniae 132, qui possèdent une structure chimique proche de celle des acides téichoïques de la même espèce, et notamment des groupes phosphate, les spectres des acides téichoïques ont pu être partiellement attribués. Les spectres enregistrés sur les quatre espèces étudiées partagent le fait que deux groupes de résonances peuvent être obser- vés : les pics peu intenses correspondent aux phosphates participant à la liai- son avec le peptidoglycane alors que les pics très intenses représentent les phosphates appartenant à la longue chaîne d’acides téichoïques. Dans le cas de
S. pneumoniae, les pics intenses entre 0 et -1 ppm correspondent aux phos-
phorylcholines et le pic vers 1,3 ppm est attribué au ribitolphosphate. Cette dernière attribution est confirmée par l’observation du spectre de B. subtilis W23, chez qui la chaîne répétitive est constituée également de ribitolphos- phate. Un pic intense y est constaté aux alentours de 1,4 ppm. Le glycérol- phosphate est quant à lui attribué à plus bas champ, vers 0,6 ppm, en se ba- sant sur le spectre de B. subtilis 168, chez qui le polymère de la chaîne princi- pale est composé de glycérolphosphate. Les deux autres pics peu intenses pré- sents sur ce spectre ont pu être attribués au phosphate lié au N-acétylmannose et à celui lié au N-acétylglucose permettant la liaison avec le peptidoglycane. Il a également été reporté dans la littérature que le déplacement chimique du glycérol substitué par l’alanine ou le glucose était déplacé de 0,2 à 0,7 ppm 133. Un effet similaire portant sur les ribitophosphates est supposé, ce qui pourrait expliquer les deux pics intenses à 1,2 ppm (le ribitol) et à 0,8 ppm (le ribitol substitué) observés sur le spectre de S. aureus. Enfin, les acides téichoïques de cette bactérie possèdent également du glycérolphosphate non-substitué, d’où l’observation d’un pic peu intense aux environs de 0,6 ppm.
Des fragments d’acides téichoïques et lipotéichoïques de bactéries va- riées ont abondamment été étudiés par RMN en phase liquide 132-134. Les seules études effectuées par RMN en phase solide concernent des échantillons lyophi- lisés. Ces études traitent de la chélation de cations métalliques par les acides téichoïques 114, 115 et de l’adsorption sur différentes surfaces des acides lipotéi- choïques 104, 105. Notre étude montre que la RMN en phase solide du phosphore d’échantillons hydratés de paroi cellulaire ou de cellules vivantes à une vitesse modérée de rotation à l’angle magique (9-12 kHz) permet d’acquérir des spec- tres possédant une résolution similaire à celle d’un spectre obtenu par RMN en phase liquide. L’abondance naturelle de 100% du noyau de phosphore 31 (1,1% pour le carbone 13), ainsi que sa sensibilité (4,2 fois celle du carbone 13)
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font de la RMN en phase solide du phosphore 31 un outil d’investigation de la paroi cellulaire des bactéries rapide et facile sans avoir besoin de recourir au
marquage isotopique. L’étude comparative de quelques bactéries en Figure 2-9
montre que l’acquisition rapide d’un spectre de bactéries entières ou de paroi cellulaire permet d’identifier facilement la bactérie étudiée.