2. Effet de l’altération des filaments d’actine sur le NMD
2.2. Résultats
Afin d’établir l’effet de la déstabilisation des filaments d’actine sur des ARNm soumis au NMD, nous avons transfecté de façon transitoire des cellules HeLa avec deux constructions rapporteurs du NMD qui sont les constructions β-globine (Gl) et glutathion peroxydase (GPx1) avec ou sans un PTC (Ter et Nor respectivement) et avec la construction Mup qui n’est pas affectée par le NMD afin de normaliser les niveaux d’expression des ARNm. Les ARNm de Gl et GPx1 sont soumis au NMD associé au noyau et au NMD cytoplasmique respectivement. Les cellules ont été traitées avec 0.5 et 1 μM de latrunculine A, cytochalasine D ou jasplakinolide pendant 2 heures.
Le traitement avec jasplakinolide induit une stabilisation d’environ 4 fois des ARNm Ter Gl et GPx1 par rapport aux Nor (Figure 30A). La cytochalasine D a un effet plus modeste, en stabilisant moins de 2 fois les deux rapporteurs (Figure 30A). Il ne semble pas y avoir une différence importante entre l’inhibition sur le NMD associé au noyau (Gl) et le NMD cytoplasmique (GPx1). Le traitement avec la latrunculine A induit rapidement le détachement des cellules et la mort cellulaire, raison pour laquelle ces cellules n’ont pas été analysées. Nous avons alors testé des doses de latrunculine A plus faibles (0.04 et 0.2 μM). Seulement à 0.04 μM les cellules ont survécu mais aucun effet sur le NMD n’a été observé (Figure 30B). Puisque le traitement avec le jasplakinolide montre la stabilisation la plus importante des ARNm rapporteurs Gl et GPx1 lorsqu’ils sont soumis au NMD, nous avons choisi de continuer nos expériences avec cette molécule.
Figure 30. Effet des molécules qui altèrent les filaments d’actine sur l’efficacité du NMD.
Les cellules HeLa ont été incubées pendant 2h avec DMSO ou avec les concentrations indiquées de (A) jasplakinolide et cytochalasine D ou (B) latrunculine A. Les niveaux d’expression des ARNm Gl et GPx1 ont été normalisés par rapport à l’expression de l’ARNm Mup.
Afin de savoir s’il était possible de faire un lien entre l’effet du traitement avec jasplakinolide sur la stabilisation des ARNm soumis au NMD et des changements dans l’organisation des filaments d’actine, nous avons effectué un marquage sur des cellules traitées avec des doses croissantes de jasplakinolide au moyen de la phalloïdine couplée au fluorophore Alexa568 (Figure 31A). La phalloïdine est une toxine isolée du champignon Amanita phalloides qui lie les filaments d’actine. Elle est couramment utilisée couplée à des fluorophores pour marquer les filaments d’actine sur des cellules fixées (Allingham et al. 2006).
Figure 31. Effet du jasplakinolide sur les filaments d’actine et l’efficacité du NMD.
Les cellules HeLa ont été incubées pendant 2h avec DMSO ou des concentrations croissantes de jasplakinolide (A) Marquage des filaments d’actine avec la phalloïdine couplée à l’Alexa568 (B) Amplification par PCR radioactive des ARNm Gl, GPx1 et Mup pour évaluer l’inhibition du NMD.
En accord avec ce qui est rapporté dans la littérature (Lazaro-Dieguez et al. 2008), nous avons observé que le traitement avec le jasplakinolide induit progressivement la désorganisation des fibres de stress d’actine et provoque la concentration de l’actine dans des agrégats amorphes (Figure 31A). De façon intéressante, nous avons observé que plus le cytosquelette d’actine est altéré, plus l’inhibition du NMD est importante (Figure 31B). Ceci suggère que la désorganisation des filaments d’actine pourrait affecter le NMD et induire la stabilisation des ARNm Gl et GPx1 porteurs de PTC.
Nous avons ensuite cherché à établir si l’inhibition du NMD que nous avons observée sur les ARNm exogènes Gl Ter et GPx1 Ter pouvait affecter aussi le NMD sur des substrats endogènes. Pour cela nous avons mesuré le niveau d’expression des ARNm TBL2, SC35 et NAT9 qui ont été précédemment montrés comme étant des transcrits cibles du NMD (Sureau et al. 2001; Viegas et al. 2007). L’analyse par PCR radioactive montre que l’expression de ces gènes n’est pas affectée significativement par l’inhibition du NMD induite avec le jasplakinolide, comme nous l’avions observé aussi avec l’amlexanox (Figure 32 et Figure 3C de l’article 1).
Figure 32. Effet du jasplakinolide sur des substrats endogènes du NMD.
Les mêmes échantillons d’ADNc analysés dans les figures 30 et 31 ont été amplifiés par PCR radioactive avec des amorces spécifiques de NAT9, TBL2 et SC35.
Il a été montré que des altérations dans le cytosquelette peuvent affecter les P-bodies dans les cellules de levure et de mammifère (Sweet et al. 2007; Aizer et al. 2008; Carbonaro et al. 2011). En particulier, le désassemblage des microtubules avec de composés chimiques comme le taxol ou le nocodazol, a pour effet d’augmenter le nombre de P-bodies (Sweet et al. 2007; Aizer et al. 2008; Carbonaro et al. 2011). Cet effet n’a pas été observé lorsque les filaments d’actine sont déstabilisés par traitement avec la cytochalasine D (Carbonaro et al. 2011). Dans le but de déterminer quel effet pourrait avoir le traitement avec le jasplakinolide sur les P-bodies, nous avons effectué des expériences d’immunofluorescence sur des cellules traitées ou non avec la molécule (Figure 33).
Figure 33. Effet du traitement avec jasplakinolide sur les P-bodies.
Les cellules HeLa ont été incubées pendant 2h avec du DMSO ou 1 μM jasplakinolide (Jpk). L’actine est marquée avec la phalloïdine-Alexa568 (rouge) et les P-bodies (vert) sont marqués avec un anticorps anti Ge-1 (A) ou observés directement après transfection de la construction YFP-DCP1a (B).
Nous avons observé que les P-bodies contenant Ge-1 diminuent en taille mais augmentent en nombre suite au traitement avec jasplakinolide. En revanche, le traitement ne semble pas affecter les P-bodies qui contiennent DCP1a (Figure 33). Il a été montré précédemment que les P-bodies pouvaient avoir une composition hétérogène (Durand et al. 2007). Nos résultats préliminaires suggèrent que la molécule peut affecter de façon différente les P-bodies contenant Ge-1 ou DCP1a.
Certains déstabilisateurs des filaments d’actine, comme la cytochalasine D, lorsqu’ils sont utilisées à des fortes doses peuvent inhiber la traduction (50% d’inhibition à 20μM) (Ornelles et al. 1986). Puisque l’inhibition de la traduction peut inhiber de façon indirecte le NMD, nous avons évalué la possibilité que la stabilisation des ARNm non-sens que nous avons observée en présence de jasplakinolide soit une conséquence d’un effet d’inhibition de la traduction par la molécule. Nous avons donc cherché à établir l’effet du jasplakinolide sur la traduction, qui n’a pas encore été rapporté dans la littérature. Pour cela, nous avons transfecté des cellules HeLa avec une construction codant pour la protéine fluorescente YFP- Globine, puis nous avons traité les cellules avec du DMSO, 1μM de jasplakinolide ou 100μg/ml de cycloheximide qui est un inhibiteur connu de l’élongation de la traduction. La fluorescence de l’YFP, qui reflète l’efficacité de la traduction, a été mesurée au moyen d’un cytomètre (Figure 34).
Figure 34. Mesure de l’efficacité de la traduction en présence de jasplakinolide.
Les cellules HeLa ont été transfectées avec la construction YFP Globine et incubées avec DMSO, jasplakinolide ou cycloheximide pendant 4h avant de mesurer la fluorescence de l’YFP.
En prenant comme 100% l’efficacité de la traduction dans les cellules traitées avec du DMSO, le traitement avec cycloheximide conduit à une efficacité de traduction de seulement 30%, en accord avec sa propriété d’inhibiteur de l’élongation. En présence de jasplakinolide, l’efficacité de la traduction est de 60% ce qui suggère que le jasplakinolide inhibe au moins
partiellement, la traduction. Néanmoins il reste à établir si l’inhibition du NMD que nous observons dans les cellules traitées avec le jasplakinolide est uniquement due à la diminution de l’efficacité de la traduction observée en présence de cette molécule ou si d’autres mécanismes sont impliqués dans la stabilisation des transcrits non-sens en présence de la molécule.