Résultats et discussions

Contrôle de la phase spectrale au foyer

Après la traversée des optiques du microscope (Fig. 2.17), les impulsions du laser, initiale- ment limitées par transformée de Fourier, comportent une phase spectrale essentielle- ment du deuxième et troisième ordre de quelques milliers de fs2 et fs3 [169]. Nous avons réalisé une pré-compensation partielle de la dispersion du microscope en translatant le miroir de repli du façonneur d’impulsions par rapport à sa position en ligne à dispersion nulle. Puis, nous avons mesuré la phase résiduelle en utilisant la méthode du balayage de la dérive de fréquence [129,147], décrite précédemment, en mesurant le spectre à deux photons avec une photodiode à deux photons GaAsP placée au foyer de l’objectif de mi- croscope 0.8 NA 40x à immersion dans l’eau. La trace obtenue du balayage de la dérive de fréquence est représentée Fig. 2.18(a). La durée des impulsions au foyer après com- pensation de la phase résiduelle a été mesurée en utilisant une mesure d’autocorrélation

interférométrique du second ordre et était (en supposant une forme temporelle gaussi- enne) de l’ordre de 14 fs (Fig. 2.18(b)). Soulignons que cette durée d’impulsion au foyer d’un objectif dont la pupille arrière est surcouverte indique que la différence des temps de propagation entre le centre et les bords de la lentille était seulement de quelques fem- tosecondes [159]. Remarquons de plus que les couplages spatio-temporels résultant de la phase appliquée par le SLM et de la translation du miroir de repli étaient acceptables dans la mesure où les mesures spectrales au foyer de l’objectif ont montré que toutes les composantes spectrales étaient correctement co-focalisées (Fig. 2.18(c)). Le spectre à deux photons correspondant à une impulsion limitée par transformée de Fourier est représenté Fig. 2.18(d) (courbe noire). Les spectres à deux photons décalé vers le bleu et décalé vers le rouge sont également représentés respectivement par les courbes bleue et rouge. Le spectre du laser au foyer de l’objectif et des phases spectrales du troisième ordre de 15000 fs3 centrées à des fréquences correspondant à 780 nm et 840 nm ap- pliquées par le façonneur d’impulsions sont représentés Fig. 2.18(c). Le choix de ces formes de phases spectrales (positions et largeurs des pics d’excitation) est le résultat d’un compromis déterminé in situ entre les niveaux de signaux et le contraste entre les fluorophores étudiés (eGFP et la fluorescence endogène de notre échantillon comme décrit dans la suite).

La Fig. 2.18 démontre qu’en utilisant un SLM 2D, les mesures d’autocorrelation et la spectrosopie par transformée de Fourier, il a été possible de caractériser et de contrôler complètement la phase spectrale et le spectre à deux photons au foyer de l’objectif de microscope.

Superposition des faisceaux façonnés

Il est important de s’assurer que les faisceaux diffractés par les deux positions du SLM 2D se recouvrent correctement au foyer de l’objectif de microscope de façon à ce que les deux faisceaux sondent le même point dans l’échantillon. Pour cela on dispose de deux degrés de liberté: on peut contrôler finement les tensions du miroir galvanométrique correspondant au deux positions du faisceau sur le SLM 2D mais on peut aussi ajuster la direction de diffraction des réseaux de phase en ajustant continument leurs périodes. En pratique, nous avons obtenu le recouvrement spatial des deux faisceaux au foyer de

(a) 380 400 420 440 460 480 -500 0 500 1000 -500 0 50 2 4 6 8 A.C. interf. 750 800 850 900 0 20 40 60 80 S.L. 750 800 850 900 -3 -2 -1 0 1 2 3 (c) Phase (rad) D.R. D.B. 380 400 420 440 0 5 10 15 (d) L.TF D.B. D.R. λ (nm) λ (nm) λ (nm) In tensité (u.a) In tensité (u.a) In tensité (u.a) Retard (fs) (c) Φ (2) (fs 2 ) A.C. intensité

Figure 2.18: (a): Trace obtenue lors d’une mesure de balayage de la dérive de fréquence avec un objectif 0.8NA 40x à immersion dans l’eau dans le cas d’une phase résiduelle du troisième ordre. (b): Autocorrelation interférométrique du deuxième ordre (courbe noire) et autocorrelation en intensité (cercles verts) correspondant à une impulsion quasi limitée par transformée de Fourier (∼ 14 fs) au foyer de l’objectif de microscope. (c) Spectre du laser (S.L.) au foyer de l’objectif de microscope et les phases spectrales du troisième ordre de 15000fs3(décalée vers le bleu D.B. et décalée vers le rouge D.R.) correspondant aux différentes formes d’impulsions utilisés dans l’expérience d’imagerie. La phase spectrale décalée vers le rouge est antisymétrique par rapport à une fréquence correspondant à λ = 840 nm et celle décalée vers le bleu est antisymétrique par rapport à une fréquence correspondant à λ = 780 nm. (d) Spectres à deux photons mesurés au foyer de l’objectif pour une impulsion quasi limitée par transformée de Fourier (L.TF), pour une phase spectrale décalée vers le bleu et vers le rouge en (c).

l’objectif de microscope en utilisant des images de billes de polystyrène fluorescentes. Une bille fluorescente de 10 µm positionnée au centre du champ de vue a été imagée en continu en utilisant un schéma d’entrelacement des images décrit dans la prochaine sous-section. Nous avons uniquement utilisé le réglage fin des tensions de contrôle du miroir galvanométrique pour faire coïncider les centres de gravité des deux images. En utilisant cette procédure nous avons obtenu une erreur de recouvrement plus petite que la résolution latérale du microscope.

Mesure de la résolution spatiale

On peut mesurer la résolution spatiale d’un microscope à deux photons en imageant un fluorophore ponctuel, auquel cas on obtient directement la réponse impulsionnelle spatiale du système optique (Point Spread Function en anglais ou PSF). En pratique, on image un objet dont les dimensions sont petites devant la taille du volume focal d’excitation. Pour cette expérience, nous avons utilisé des billes fluorescentes de 100 nm de diamètre que nous avons imagées en 3D à la fois au centre du champ de vue et sur les bords. La Fig. 2.19 représente les PSF axiale et latérale correspondant aux faisceaux diffractés par les deux positions de SLM 2D (haute et basse). Ces données montrent que notre schéma de façonnage est compatible avec l’imagerie microscopique avec une résolution axiale de 2 µm et une résolution latérale de 0.49 µm.

Imagerie multiplexée avec deux formes d’impulsions

Le montage expérimental est représenté Fig. 2.17. Le train d’impulsions était tout d’abord envoyé vers le façonneur d’impulsions commutable puis dans le microscope à balayage. Avec une efficacité globale du façonneur d’impulsions de l’ordre de 25 %, nous disposions d’une puissance moyenne de l’ordre de 15 mW au foyer de l’objectif de microscope. Nous avons fait l’acquisition simultanée de paires d’images avec des formes d’impulsions différentes en balayant chaque ligne deux fois et en commutant la position du miroir galvanométrique entre deux lignes. Les formes des fonctions utilisées pour contrôler les trois miroirs galvanométriques (X, Y dans le microscope et G dans la ligne 4f) sont représentées Fig. 2.17. Les images correspondant aux deux formes d’impulsions ont été obtenues en désentrelaçant les données. Ce schéma d’acquisitions entrelacées rend possible l’imagerie simultanée à l’échelle de la milliseconde avec une

Centre 0.5 1 1.5 2 2.5 0 1 (c) Bottom Top 0 1 2 3 4 5 0 1 (e) Bottom Top 0.5 1 1.5 2 2.5 0 1 (d) Bottom Top 0 1 2 3 4 5 0 1 (f) Bottom Top Côté (b) (a) In tensité (u.a) In tensité (u.a) In tensité (u.a) In tensité (u.a) FWHM ∼ 2 µm FWHM ∼ 0.49 µm X (µm) Z (µm) X (µm) Z (µm)

Figure 2.19: (a) et (b): Images de billes de 100 nm situées (a) au centre et (b) sur les bords du champ de vue. La barre d’échelle correspond à 1 µm. Chaque image a été obtenue en mélangeant deux images: l’une a été prise avec la phase spectrale décalée vers le rouge (en vert) et l’autre avec la phase spectrale décalée vers le bleu (en bleu). (c), (d): PSF en intensité radiales mesurées à partir des images de billes représentée en (a) et (b) et correspondant aux faisceaux diffractés par la position haute (top) et basse (bottom) du SLM 2D. La largeur à mi-hauteur est de 0.49 µm. (e), (f): PSF en intensité axiales mesurées avec les mêmes billes. La largeur à mi-hauteur est de 2 µm.

reproductibilité spatiale pixel à pixel entre deux images. Par conséquent, des opérations comme des combinaisons linéaires des images ont été possibles.

Microscopie de fluorescence sélective d’un embryon en développement avec des impulsions façonnées

Nous allons maintenant voir que notre dispositif peut produire des images multiplexées de tissus évoluant rapidement avec une résolution micrométrique.

Nous avons imagé des embryons vivants de Drosophile (Drosophila melanogaster ) pen- dant l’étape de gastrulation. Durant cette étape, les tissus (blastoderme) se réorgan- isent en une structure à trois couches par un mouvement d’ensemble complexe des cel- lules [170]. Au début de la gastrulation, les cellules forment une couche unique distribuées à la périphérie de l’embryon de forme ovoïde (500 µm x 200 µm). Pendant l’acquisition des images, les embryons sont maintenus dans une solution tampon phosphate salin

(Phosphate Buffered Saline en anglais ou PBS) à température ambiante (20 ±1˚C). Ces drosophiles sont issues d’une variété transgénique dont les noyaux cellulaires sont marqués avec la protéine fluorescente eGFP [171]. Les embryons présentent une dis- tribution compartimentée de fluorophores ce qui les rend particulièrement bien adaptés pour valider notre approche. Le centre de l’embryon est rempli par le stock vitellin qui contient une grande concentration de vésicules de stockage, dont certaines ont une forte fluorescence endogène bleue. Les spectres d’excitation à deux photons de la eGFP et de la fluorescence endogène sont suffisamment différents pour être sondés sélectivement en façonnant le spectre à deux photons de façon adaptée [23].

Nous avons enregistré une séquence d’images 2D et 3D du pôle postérieur de l’embryon pendant la phase de convergence-extension de la gastrulation, un processus rapide qui implique une réorganisation spatiale à grande échelle des tissus et des réserves vitellines, notamment dans les régions postérieure et dorsale des embryons. Les Fig. 2.20(a) et (b) montrent des images enregistrées simultanément avec deux formes d’impulsions dif- férentes démontrant l’excitation préférentielle de eGFP ou de la fluorescence endogène. L’image de la Fig. 2.20(a) a été obtenue avec une phase antisymétrique centrée à 780 nm (représentée Fig. 2.18(b)) qui permet une excitation accrue de la fluorescence en- dogène (bleue). L’image de la Fig. 2.20(b) a été obtenue de façon quasi-simultanée en utilisant une phase antisymétrique centrée à 840 nm (représentée Fig. 2.18(b)) qui per- met une excitation accrue de eGFP localisée dans les noyaux cellulaires. Dans cette expérience, nous avons fait l’acquisition d’images de 580 lignes de 620 pixels chacune à une fréquence pixel de 75 kHz, et une image a été enregistrée toutes les 7 secondes pendant 40 minutes. Le temps d’acquisition par ligne de 12 ms (limité par le choix du nombre de pixels) définit la résolution temporelle de l’excitation multiplexée. Notons que le temps d’acquisition des images de l’ordre de 6 secondes par image est une amélio- ration de plus de deux ordres de grandeur par rapport au schéma de commutation basé sur un façonneur d’impulsions acousto-optique [23] et que la fréquence pixel est simi- laire à celle typiquement utilisée dans les microscopes à deux photons standards. Les Fig. 2.20(c) et (d) représentent des combinaisons linéaires des images (a) et (b) pour sé- parer les composantes de fluorescence basées sur leurs spectres d’absorption. Ces images montrent qu’un excellent recouvrement entre les deux faisceaux a été obtenu sur tout le

champ de vue et illustrent la sélectivité obtenue par un façonnage en phase spectrale. Les Fig. 2.20(e) et (f) présentent des images obtenues en combinant (c) et (d) à deux différentes étapes de développement de l’embryon. Les kymographes (projections spatio- temporelles) révèlent les mouvement corrélés des cellules Fig. 2.21(b) et des structures vitellines sous-jacentes (a) pendant les mouvements d’extension. Enfin, la Fig 2.21(c) est extraite d’un film http://www.opticsexpress.org/viewmedia.cfm?URI=oe-17-15-12741-1 qui montre une reconstruction 3D du pôle postérieur d’un autre embryon imagé depuis le côté dorsal pendant 32 minutes couvrant la phase de convergence-extension. Une image 3D a été enregistrée toutes les minutes. Finalement, ces données montrent que notre système permet une imagerie multiphoton entrelacée avec deux formes d’impulsions ar- bitraires, une vitesse d’acquisition standard et une résolution micrométrique dans des tissus intacts.