Conclusion sur l’expérience et perspectives

Cette expérience montre que notre schéma de façonnage combiné au multiplexage tem- porel permet d’imager simultanément trois fluorophores avec une source laser commer- ciale produisant des impulsions de spectre 100 nm à mi-hauteur. Les disparités impor- tantes de niveaux de signaux des fluorophores de l’échantillon ont imposé des temps d’acquisition longs (38 s par image) ce qui n’est pas une limite de la méthode en elle- même mais plutôt de la microscopie 2PEF en régime de comptage de photons. Les temps de vie de fluorescence sont à l’origine d’une diaphonie importante entre les dif- férents canaux de détection, ce qui réduit le gain de contraste offert par la sélectivité à l’excitation. On peut envisager deux types de solutions pour réduire cet effet: soit l’utilisation d’un laser dont le taux de répétition est plus faible, ou bien utiliser un miroir galvanométrique pour envoyer alternativement le faisceau dans un bras avec un matériau dispersif puis dans un autre bras sans. Il est remarquable de pouvoir distinguer trois fluorophores proches (bleus) avec un bon contraste et en une mesure. Combinée avec un spectre encore plus large, cette expérience laisse entrevoir la possibilité d’imager encore

plus de fluorophores simultanément.

2.8

Conclusion

Dans ce chapitre, nous avons tout d’abord décrit un nouveau schéma de façonnage qui permet la commutation rapide entre des formes d’impulsions arbitraires combiné avec un SLM 2D adressé optiquement, dont les masques diffractifs permettent le façonnage à la fois en phase et en amplitude. Nous avons utilisé ce façonneur à commmutation rapide pour réaliser une expérience de microscopie sélective dans un embryon en cours de développement avec des temps d’acquisition et une résolution standards pour un micro- scope à deux photons. Cette expérience a permis de valider l’utilisation d’une phase du troisième ordre pour contrôler l’excitation de plusieurs fluorophores et a ouvert la voie à une implémentation beaucoup plus simple. En effet, nous avons montré qu’un com- presseur à prismes, combiné avec des morceaux de verre permet de produire des phases spectrales du troisième ordre tout à fait adaptées pour l’imagerie sélective et compatibles avec un schéma de multiplexage temporel des impulsions qui permet une fréquence de commutation de 150 MHz entre les impulsions excitatrices. Enfin, nous avons utilisé ce schéma simple et efficace pour imager simultanément trois fluorophores spectrale- ment proches. Pour cela nous avons combiné l’excitation sélective avec l’approche plus classique du filtrage spectral de la fluorescence émise par l’échantillon. Avec un laser à forte cadence (2 x 75 MHz) le contraste est modéré par le phénomène de diaphonie: des photons de fluorescence émis tardivement sont attribués au mauvais canal d’excitation. Pour éviter cet effet, il faudrait donc utiliser un laser avec un taux de répétition moindre. Enfin, l’utilisation d’impulsions de spectre plus large permettra d’imager simultanément un plus grand nombre de fluorophores.

Sommaire

2.1 Introduction . . . . 81 2.2 La microscopie de fluorescence excitée à deux photons . . . 82

2.2.1 L’absorption à deux photons . . . 82 2.2.2 Intérêt pour la microscopie . . . 82

2.3 Excitation sélective et microscopie 2PEF . . . . 84

2.3.1 Intérêt pour l’imagerie biologique . . . 84 2.3.2 Le signal de fluorescence . . . 84 2.3.3 Contrôler l’absorption à deux photons . . . 86 2.3.4 Forme d’impulsion optimale . . . 94 2.3.5 Conclusion . . . 95

2.4 Les méthodes de mesure au foyer d’un objectif . . . . 95

2.4.1 Choix des techniques de caractérisation . . . 97 2.4.2 Mesure de la durée des impulsions . . . 98 2.4.3 Balayer la dérive de fréquence . . . 102 2.4.4 FROG interférométrique . . . 105 2.4.5 Mesure du spectre à deux photons . . . 109 2.4.6 Conclusion . . . 113

2.5 Microscopie d’un échantillon biologique dynamique avec des impulsions façonnées . . . . 114

2.5.2 Façonnage d’impulsions et commutation rapide . . . 115 2.5.3 Résultats et discussions . . . 118 2.5.4 Conclusion sur l’expérience . . . 124

2.6 Façonnage d’impulsions avec des prismes pour la micro- scopie à deux photons multiplexée . . . . 127

2.6.1 Façonner avec des éléments dispersifs . . . 127 2.6.2 Multiplexage temporel des impulsions . . . 129 2.6.3 Spectres à deux photons . . . 130 2.6.4 Microscopie à deux photons sélective d’un embryon en développe-

ment . . . 131

2.7 Microscopie à deux photon multiplexée de trois fluorophores 133

2.7.1 Imager plus de fluorophores . . . 134 2.7.2 Multiplexage temporel . . . 134 2.7.3 Choix des bandes spectrales de détection . . . 135 2.7.4 Formes des spectres à deux photons . . . 136 2.7.5 Microscopie d’un échantillon biologique avec trois fluorophores 139 2.7.6 Conclusion sur l’expérience et perspectives . . . 144

2.8 Conclusion . . . . 145 Nous allons maintenant aborder une tout autre application du façonnage d’impulsions: la mesure optimale d’un paramètre contenu dans la dépendance temporelle d’un champ électromagnétique. Cette approche originale a été développée par le groupe d’Optique Quantique Multimode du Laboratoire Kastler Brossel (LKB) à l’Ecole Normale Supérieure (ENS). Dans le cadre d’un projet intitulé Qualitime, porté par Nicolas Treps au LKB et soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche, notre travail au LOB a consisté à développer une stratégie de façonnage adaptée à cette problématique ainsi qu’à la mettre en œuvre expérimentalement. Les aspects théoriques décrits en début de chapitre sont inspirés du manuscrit de thèse d’Olivier Pinel [25].

3.1

Problématique

L’enjeu des expériences que nous allons décrire dans ce chapitre est de transmettre à distance les fluctuations δp d’un paramètre p par l’intermédiaire d’un champ électrique

porté par un faisceau lumineux. Nous nous intéressons au cas où l’intensité de ce champ ne dépend pas du paramètre, ce cas ayant déjà été étudié par le passé [181–183]. Nous noterons par la suite E (p) le champ électrique complexe dépendant du paramètre p, qui dépend implicitement des variables habituelles de temps, ou de fréquence optique et d’espace. Nous ne cherchons pas à optimiser la dépendance du champ électrique avec le paramètre p, mais nous nous intéressons exclusivement à la mesure de ses fluctu- ations. Par conséquent, nous laissons à l’expérimentateur le soin de perfectionner la dépendance du champ électrique avec le paramètre et nous la considérons comme une donnée du problème. En d’autres termes, nous disposons d’un champ électrique E (p) et nous souhaitons mesurer les fluctuations de p avec une sensibilité maximale. Nous allons tout d’abord étudier la cas purement classique, c’est-à-dire où le champ électrique ne subit aucune fluctuation d’origine quantique, puis nous nous intéresserons à la limite quantique standard, en négligeant toute autre origine de bruit.