Material and methods
II. Résultats complémentaires : Rôle de Netrin-1 dans le guidage du FCS à la ligne médiane
NETRIN1, le ligand de DCC, est exprimé par de nombreuses structures au niveau de la ligne médiane du système nerveux central (Kennedy et al., 1994; Keino-Masu et al., 1996). L’effet chimio-attractif de NETRIN-1 permet aux axones commissuraux exprimant DCC de se diriger vers la ligne médiane puis de la franchir. Les mutants murins Dcc-/- et Netrin1 -/-présentent des phénotypes similaires. En l’absence de Netrin-1, de nombreuses populations d’axones commissuraux exprimant DCC sont incapables de franchir la ligne médiane, notamment les commissures du cerveau antérieur ainsi que les axones commissuraux de la moelle (Serafini et al., 1996; Fazeli et al., 1997). Etant donné que les souris Netrin1-/- meurent à la naissance (Serafini et al., 1996), le rôle de cette molécule dans le développement du FCS n’a pas été étudié en détail. L’équipe d’Alain Chédotal a généré des mutants conditionnels présentant une délétion totale de Netrin1 dans la plaque du plancher (floor plate) au niveau de la moelle et du tronc cérébral (souris Shh::cre ;Netrinlox/lox). Cette lignée étant viable, nous avons analysé l’anatomie du FCS ainsi que le comportement moteur de ces mutants.
Nous avons procédé à des injections de BDA (biotinylated dextran amine) dans le cortex moteur gauche de souris adultes Shh::cre;Netrinlox/lox (n = 2), Shh::cre;Netrinlox/- (n = 2) et Netrinlox/lox (n = 3), comme décrit ci-dessus (Article 1 ; Figure 18A). Nous avons ensuite visualisé le FCS à différents niveaux du tronc cérébral et de la moelle. Dans la partie antérieure du tronc cérébral (avant l’OI), le FCS était similaire entre les mutants et les contrôles. En revanche, l’anatomie du FCS était anormale au niveau de l’OI chez les souris
Shh::cre;Netrinlox/lox. Tandis que chez les souris contrôle, le FCS est situé en position ventro-médiale, en dessous de l’olive (Figure 18C), nous avons observé que le FCS et l’olive étaient
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Figure 18. L’anatomie du FCS est anormale chez les souris Shh::cre;Netrinlox/lox. (A) Représentation schématique d’une coupe sagittale de cerveau de souris adulte indiquant le niveau des coupes coronales présentées dans la figure. Nous avons injecté de la BDA dans le cortex moteur gauche de souris Shh::cre ;Netrinlox/lox, Shh::cre ;Netrinlox/- et Netrinlox/lox afin de marquer les axones corticospinaux. Le FCS a été visualisé au niveau du tronc cérébral ou de la décussation par immuno-marquage anti-PKC! ou par révélation de la BDA. Nous avons utilisé un immuno-marquage anti-Calb1 afin de marquer les neurones de l’olive inférieure (IO). La trajectoire du FCS était anormale chez les mutants Shh::cre ;Netrinlox/lox et
Shh::cre ;Netrinlox/-. Au sein du tronc cérébral, chez les souris contrôles, le FCS était situé en position ventro-médiale, en dessous de l’olive (C), tandis que le FCS et l’olive s’étalaient anormalement en position latérale chez les mutants (comparer B et C). Au niveau de la décussation, une partie des axones corticospinaux croisait la ligne médiane, tandis que la majorité restait au sein de la moelle ipsilatérale, en position ventrale (comparer D et E). Les flèches blanches indiquent le FCS. CST : corticospinal tract; IO : inferior olive. La barre d’échelle représente 320 µm dans B-E.
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Figure 19. Organisation anormale du FCS dans la moelle chez les mutants Shh::cre;Netrin1lox/lox (suite de la figure 18). Au niveau de la moelle, trois composantes
distinctes du FCS ont été identifiées chez les souris mutantes : (1) une partie des axones corticospinaux se trouvaient à son emplacement normal, dans le cordon dorsal de la moelle contralatérale à l’hémisphère d’origine (A, A’, B, B’) ; la majeure partie des axones n’avaient pas franchi la ligne médiane, et étaient restés au sein de la moelle ipsilatérale (2) en position ventrao-médiale, ou (3) en position ventro-latérale (A, A’, C, C’). Au contraire, chez les contrôles, l’ensemble des axones corticospinaux se trouvait dans le cordon dorsal de la moelle contralatérale (D, D’, E, E’), et aucune fibre n’a été observée au niveau du cordon ventral (F, F’). Les flèches blanches indiquent le faisceau corticospinal. L’échelle représente 640 µm dans A, D et 320 µm dans B, C, E, F.
188) RESULTATS!
188 anormalement étalés latéralement chez les mutants (Figure 18B). Au niveau de la décussation, une partie des axones corticospinaux parvenaient à franchir la ligne médiane, tandis que la majorité d’entre eux restait en position ventrale (comparer Figure 18D et 18E). En conséquence, l’organisation du FCS dans la moelle épinière des souris Shh::cre;Netrinlox/lox était complètement anormale, et trois composantes distinctes du FCS ont été identifiées : (i) une partie des axones corticospinaux se trouvait à son emplacement normal, dans le cordon dorsal de la moelle contralatérale à l’hémisphère d’origine (Figure 19A, A’, B, B’) ; la majeure partie des axones n’avait pas franchi la ligne médiane et était restée au sein de la moelle ipsilatérale (ii) en position ventro-médiale ; ou (iii) en position ventro-latérale (Figure 19 A, A’, C, C’). Au contraire, chez les souris contrôles, l’ensemble des axones corticospinaux se trouvait dans le cordon dorsal de la moelle contralatérale (Figure 19 D, D’, E, E’), et aucune fibre n’a été détectée au niveau du cordon ventral (Figure 19 F, F’). Nous avons observé les mêmes défauts chez les souris Shh::cre;Netrinlox/-.
Nous avons ensuite analysé le phénotype moteur de souris Shh::cre;Netrinlox/lox (n = 10) et de contrôles Netrinlox/lox (n = 10) en utilisant les tests comportementaux décrits précédemment (Article 1). Il n’y avait pas de différence de poids entre les deux groupes (t test, p = 0.653, Figure 20A). La distance parcourue par les souris Shh::cre;Netrinlox/lox dans l’open-field était moins importante que celle parcourue par les contrôles (t test, p = 0.004, Figure 20B). Les performances des deux groupes étaient similaires pour le test de la force musculaire (t test, pantérieur = 0.271 ; ppostérieur = 0.367, Figure 20C), du rotarod (2x2 ANOVA, F = 1.590, p = 0.223, Figure 20D), du treadmill (test de Mann-Whitney, pantérieur = 0.739, ppostérieur = 0.315, Figure 20E) et de l’échelle de marche (2x2 ANOVA, F = 18, p = 0.395, Figure 20G). Nous avons ensuite utilisé des tests permettant d’évaluer de façon plus spécifique les conséquences de défauts anatomiques du FCS. Au cours de la locomotion libre,
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Figure 20. Netrin-1 est impliquée dans la génération de mouvements asymétriques des membres antérieurs. Nous avons analysé le phénotype moteur de souris
Shh::cre ;Netrinlox/lox et de contrôles Netrinlox/lox. Il n’y avait pas de différence de poids entre les deux groupes (t test, p = 0.653, A). La distance parcourue dans l’open-field par les souris
Shh::cre;Netrinlox/lox était moins importante que celle parcourue par les contrôles (t test, p = 0.004, B). Les performances des deux groupes étaient similaires pour le test de la force musculaire (t test, pantérieur = 0.271 ; ppostérieur = 0.367, C), du rotarod (2x2 ANOVA, F = 1.590, p = 0.223, D), du treadmill (test de Mann-Whitney, pantérieur = 0.739, ppostérieur = 0.315, E) et de l’échelle de marche (2x2 ANOVA, F = 18, p = 0.395, G). Les souris Shh::cre ;Netrinlox/lox produisaient des mouvements majoritairement symétriques avec les membres antérieurs au cours des tests du treadmill avec obstacles (test de Mann Whitney, pantérieur = 0.029, ppostérieur = 0.19, F) et du « reaching » exploratoire (test de Mann Whitney, p = 0.075, H).
190) RESULTATS!
190 les circuits impliqués dans la génération des mouvements alternés des membres sont principalement spinaux. Au contraire, lors de phases de locomotion nécessitant de franchir des obstacles, un contrôle supra-spinal est mis en jeu et fait intervenir le FCS (Borgius et al., 2014; Serradj et al., 2014; Welniarz et al., 2015). Au cours de la locomotion avec obstacles, la proportion de mouvements symétriques produits avec les membres antérieurs était plus importante chez les souris Shh::cre;Netrinlox/lox que chez les contrôles (test de Mann Whitney, pantérieur = 0.029, ppostérieur = 0.19, Figure 20F). Lorsque les souris sont placées dans un nouvel environnement, elles ont tendance à se redresser sur leurs membres postérieurs et à établir des contacts avec la paroi avec leurs membres antérieurs, de façon asymétrique ou symétrique (Serradj et al., 2014). Au cours de ce test du reaching exploratoire, les souris
Shh::cre;Netrinlox/lox ont produit plus de mouvements symétriques que les souris contrôles (test de Mann Whitney, p = 0.075, Figure 20H).
Ces résultats soulignent l’importance du couple NETRIN1-DCC dans le développement du système moteur, et en particulier du FCS. Il est intéressant de remarquer que les mutants Shh::cre;Netrinlox/lox, au même titre que les souris Dcckanga, présentent une association entre des défauts de guidage du FCS à la ligne médiane et des anomalies anatomiques de l’OI. Nous discuterons de façon plus approfondie ces résultats dans la partie II. B de la discussion.
RESULTATS) 191!
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