Résultats de l’approche MALDI-TOF

Les souches isolées ont fait l’objet d’une identification complémentaire en utilisant un spectromètre de masse MALDI-TOF présent sur la plateforme Anses basée au Laboratoire d’Hydrologie de Nancy (LNH-Anses). L’objectif a consisté dans un premier temps à confirmer le genre et l’espèce des souches isolées, puis dans un second temps de voir si des diffé- rences entre les souches et les milieux de cultures utilisés pouvaient être visualisées. Des spectres de référence ont été obtenus à partir d’extraits protéiques totaux, puis ils ont été comparés à la banque spectrale du fabriquant. Les résultats d’identification sont communi- qués sous forme d’un tableau regroupant les espèces les plus probables.

1. Préparation et traitement des échantillons

L’analyse a été effectuée sur les quatre souches isolées issues de cultures sur les deux milieux et conditions d’incubation présentés précédemment. La préparation de l’extrait total est réalisée selon la méthode dite acide formique/éthanol. Plusieurs colonies d’une même souche regroupées à l’aide d’une öse sont mélangées à 300 µL d’eau distillée de fa- çon à avoir une suspension trouble. 900 µL d’éthanol sont ensuite ajoutés et la solution est bien homogénéisée, puis centrifugée 2 minutes à 13000 rpm. Le surnageant est éliminé et le culot séché. Ensuite, 15 µL d’acide formique sont ajoutés au culot pour le reprendre et 15 µL d’acétonitrile sont additionnés. Le tout est bien homogénéisé et centrifugé 2 minutes à 13000 rpm. Après centrifugation, 1 μL de surnageant est ensuite distribué dans la zone, matériali- sée par un cercle, d’une plaque de 48 positions à raison de 8 dépôts d’extrait protéique par souche. Une fois les dépôts bien secs, 1,2 μL d’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique, sont distribués sur chaque dépôt. Pour chaque série analytique, 1 μL de solution standard conte- nant un extrait protéique d’E. coli est également distribué servant d’étalon de calibration et de contrôle du bon déroulement de l’analyse. Après séchage la plaque est introduite dans le spectromètre Microflex LT (Bruker, France). Pour chaque dépôt, trois spectres sont acquis, ainsi 24 spectres sont obtenus par souche. Les analyses sont réalisées selon une séquence précise visant dans un premier temps à ioniser et désorber les protéines à l’aide d’un laser puis générer un spectre de masse après impact des ions sur un détecteur à l’extémité du tube de vol. Le spectre acquis sur la plage allant de 1000 à 12000 m/z est ensuite comparé à la bibliothèque spectrale du fabricant. La fiabilité de l’identification repose sur le score obtenu dont l’interprétation dépend de la valeur générée : identification très probable de l’espèce (> 2,300), probable (2,000 < n < 2,300) et identification probable du genre bactérien (1,700 < n < 1,900). Des études préliminaires menées à l’Anses semblent indiquer qu’un niveau addi- tionnel de fiabilisation du résultat peut être apporté en se basant sur le calcul de l’écart-type relatif (figure 6-2) de la distribution des scores. Ainsi, il a été observé qu’une valeur de cet écart-type inférieure à 5% conduit à une identification robuste de l’espèce bactérienne de la souche analysée.

Tableau VI-I : Résultats d’identification des quatre souches de S. baltica par analyse en MALDI-TOF

Souches Milieu TSA-YE-NaCl Milieu OTMA-TSA-YE-NaCl

Score a _CV% b _{Identification} c _Score a _CV% b _{Identification} c

14LSABSM1SHW 2,402 2,8% Shewanella baltica 2,391 1,7% Shewanella baltica 14LSABSM2SHW 2,355 2,7% Shewanella baltica 2,300 4,0% Shewanella baltica 14LSABSM3SHW 2,330 2,0% Shewanella baltica 2,341 1,4% Shewanella baltica 14LSABSM4SHW 2,294 3,1% Shewanella baltica 2,339 2,1% Shewanella baltica

a _{Score moyen obtenu à partir de 24 mesures (3 répétitions sur 8 dépôts d’extraits protéiques) pour}

chacune des souches. b Valeur de l’écart-type relatif du score moyen obtenu pour chaque souche. c Identification de la souche selon la base de données Bruker, à l’heure de la rédaction de ce manuscrit seul un spectre de référence, celui de la souche de S. baltica DSM 9439T, compose cette base de données.

Tableau VI-II : Résultats de validation croisée d’identification des souches.

Croissance sur milieu TSA-YE-NaCl

14LSABSM1SHW 14LSABSM2SHW 14LSABSM3SHW 14LSABSM4SHW

Identification a _Score b _{% CV} c _{Identification} a _Score b _{% CV} c _{Identification} a _Score b _{% CV} c _{Identification} a _Score b _{% CV} c

Sb1 TSA 2,769 2,8% Sb2 TSA 2,809 2,1% Sb3 TSA 2,758 2,0% Sb4 TSA 2,738 2,1% Sb2 TSA 2,700 2,4% Sb1 TSA 2,716 2,1% Sb1 TSA 2,692 1,6% Sb4 OTMA 2,550 3,3% Sb3 TSA 2,672 2,4% Sb2 OTMA 2,625 2,0% Sb3 OTMA 2,607 1,7% Sb1 OTMA 2,507 4,8% Sb1 OTMA 2,628 2,4% Sb3 TSA 2,624 2,3% Sb2 TSA 2,607 2,0% Sb1 TSA 2,504 4,3% Sb3 OTMA 2,572 2,8% Sb1 OTMA 2,596 2,3% Sb1 OTMA 2,579 2,0% Sb3 TSA 2,484 4,4% Sb2 OTMA 2,558 2,4% Sb3 OTMA 2,511 2,3% Sb4 OTMA 2,565 1,5% Sb2 TSA 2,483 3,5% Sb4 OTMA 2,553 2,4% Sb4 OTMA 2,510 2,1% Sb2 OTMA 2,513 1,7% Sb3 OTMA 2,450 4,9% Sb4 TSA 2,503 2,9% Sb4 TSA 2,492 2,2% Sb4 TSA 2,503 2,1% Sb2 OTMA 2,373 3,6% Sp TSA 1,944 4,2% Sp TSA 1,813 5,4% Sp TSA 1,985 3,3% Sp OTMA 1,782 8,7% Sp OTMA 1,764 6,7% Sp OTMA 1,668 6,3% Sp OTMA 1,739 5,8% Sp TSA 1,750 10,4%

Croissance sur milieu OTMA-TSA-YE-NaCl

14LSABSM1SHW 14LSABSM2SHW 14LSABSM3SHW 14LSABSM4SHW

Identification a _Score b _{% CV} c _{Identification} a _Score b _{% CV} c _{Identification} a _Score b _{% CV} c _{Identification} a _Score b _{% CV} c

Sb1 OTMA 2,755 1,9% Sb2 OTMA 2,666 4,5% Sb3 OTMA 2,757 1,1% Sb1 OTMA 2,657 2,1% Sb1 TSA 2,650 2,4% Sb2 TSA 2,556 3,2% Sb4 OTMA 2,649 1,5% Sb1 TSA 2,593 2,3% Sb4 OTMA 2,633 1,9% Sb3 OTMA 2,546 4,4% Sb3 TSA 2,627 1,5% Sb2 OTMA 2,596 1,8% Sb3 OTMA 2,631 2,1% Sb1 TSA 2,539 3,2% Sb1 OTMA 2,616 2,0% Sb2 TSA 2,516 2,4% Sb2 OTMA 2,597 1,8% Sb1 OTMA 2,531 2,9% Sb1 TSA 2,594 2,0% Sb3 OTMA 2,654 1,7% Sb3 TSA 2,584 2,3% Sb4 OTMA 2,508 4,5% Sb2 OTMA 2,593 1,1% Sb3 TSA 2,612 2,0% Sb2 TSA 2,582 2,3% Sb3 TSA 2,500 3,3% Sb2 TSA 2,495 2,2% Sb4 OTMA 2,780 1,7% Sb4 TSA 2,542 2,3% Sb4 TSA 2,358 2,9% Sb4 TSA 2,469 2,2% Sb4 TSA 2,590 2,3% Sp TSA 1,938 4,1% Sp TSA 1,788 7,4% Sp TSA 1,959 3,9% Sp OTMA 1,861 3,5% Sp OTMA 1,780 6,7% Sp OTMA 1,451 12,3% Sp OTMA 1,741 7,1% Sp TSA 1,987 3,6%

a _{Identification des souches avec la codification suivante Sb1 : 14LSABSM1SHW, Sb2 : 14LSABSM2SHW, Sb3 : 14LSABSM3SHW,}

Sb4 : 14LSABSM4SHW, Sp : S. putrefaciens DSM 6067, TSA : croissance sur milieu TSA-YE-NaCl et OTMA : croissance sur milieu OTMA-TSA-YE-NaCl. Ainsi Sb1 OTMA correspond au spectre de référence de 14LSABSM1SHW issu d’une croissance sur milieu TSA-YE-NaCl. b _{Score moyen obtenu à partir de 24 mesures (3 répétitions sur 8 dépôts d’extraits protéiques) pour chacune des}

Caractérisation de souches de S. baltica issues d’un poisson altéré

2. Résultats

Comme le montre le Tableau VI-I, l’analyse des extraits protéiques totaux en MALDI- TOF permet de confirmer l’identification génotypique réalisée précédemment par séquen- çage partiel du gène de l’ARNr 16S et de gyrB. L’identification des souches est fiable compte-tenu du fait que les scores et les écart-types relatifs satisfont les critères précédem- ment définis. Seul le score de la souche 14LSABSM4SHW issue d’une culture sur le milieu TSA-YE-NaCl ne donne qu’un résultat probable, néanmoins compte-tenu du score moyen et de la valeur de l’écart-type relatif inférieure à 5%, l’identification semble fiable.

Ensuite, l’impact des conditions de culture a été analysé. En effet, l’ajout d’OTMA au milieu TSA-YE-NaCl favorise le développement des souches en conditions anaérobies en activant la synthèse de l’opéron tor. La comparaison visuelle des spectres permet de mettre en évidence certains pics apparaissant/disparaissant en fonction des conditions de culture. Ainsi la croissance en anaérobiose sur le milieu OTMA-TSA-YE-NaCl conduit à l’apparition de trois pics sur le spectre de masse à 2218 m/z, 4442 m/z, 8508 m/z, et la disparition du pic enregistré à 3354 m/z sur milieu TSA-YE-NaCl. Si ces différences sont visibles sur les spectres d’identification, l’origine de ces changements n’est pas connue : en effet le travail est réalisé sur un mélange protéique, de plus l’utilisation d’un analyseur en dimension simple limite l’information contenue dans le spectre. Enfin, si des différences ont pu être identifiées par cette approche, les conclusions concernant les scores (Tableau VI-II) sont identiques à celles du paragraphe précédent. La variabilité des spectres est trop faible avec l’approche utilisée pour pouvoir différencier les conditions de culture.

Une dernière approche s’est intéressée à la discrimination de souches d’une même espèce. La comparaison visuelle des spectres ne permet pas d’observer des zones de spectre différenciant les quatre souches. Néanmoins, une validation croisée des données (Tableau VI-II) a montré que le score le plus élevé correspond généralement à la bonne souche, sauf à deux exceptions, mais les scores des autres souches sont extrêmement proches l’écart le plus élevé étant de 0,108. De plus, la réalisation d’ACP montre a posteriori l’existence de groupes distincts composés des différentes répétitions réalisées par souche, sans pouvoir identifier les causes de ces regroupements. Ainsi, il doit exister de faibles diffé- rences entre les protéomes de chaque souche, même si cela n’est pas discernable lors d’une comparaison visuelle des spectres.

La technique MALDI-TOF a donc permis de confirmer l’identification des souches de S. baltica. Des comparaisons visuelles de spectres ont montré quelques différences en fonc- tion des conditions de culture, mais aucune entre les quatre souches. L’utilisation d’outils de statistiques multivariées, plus puissants, a montré que des différences existent sans en ex- pliquer les causes. Ceci illustre les limites de la comparaison visuelle de spectres. A terme, une comparaison plus fine des spectres et une identification plus fiable de l’origine des diffé- rences observées serait à envisager en utilisant un traitement statistique.