La résistance acquise

Les différents mécanismes qui permettent aux bactéries d’acquérir ou de développer des résistances sont classés en trois principaux groupes :

la réduction de la concentration intracellulaire de l’antibiotique la modification de la cible

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2.2.1. La réduction de la concentration intracellulaire de l’antibiotique

La réduction de la concentration intracellulaire de l’antibiotique est une conséquence de la réduction de la perméabilité membranaire et de l’augmentation du phénomène d’efflux.

2.2.1.1. Réduction de la perméabilité membranaire

Les bactéries Gram négatif sont naturellement peu perméables à plusieurs antibiotiques grâce à leur membrane externe qui joue le rôle de filtre (Nikaido, 1994). Des systèmes de transport, essentiellement des porines, sont donc nécessaires pour le passage des molécules, et notamment des molécules hydrophiles.

Certaines de ces porines, à l’instar des porines OmpF et OmpC d’Escherichia coli, s’assemblent en trimères au sein de la membrane externe des bactéries Gram négatif, d’autres, telles que OmpG étant monomérique (Fig. 12). Les monomères forment des tonneaux β transmembranaires. Les brins β sont reliés par des boucles extracellulaires exposées à la surface, plus ou moins longues selon les porines, et des boucles périplasmiques plus petites. Des boucles spécifiques sont localisées à l’intérieur de la porine (au centre du tonneau) formant avec les résidus hydrophiles de certains brins β, la zone de constriction de la porine. Même si cette zone de constriction (50 à 100 Å de diamètre suivant l’état d’hydratation) permet de limiter l’entrée dans la cellule à des molécules d’une certaine taille, les porines sont pour la plupart non spécifiques, le transport s’effectuant par diffusion (Kojima & Nikaido, 2013).

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Figure 12 : Structures d’une porine monomérique (OmpG) et d’une porine trimérique (OmpF) d’E. coli. Code

PDB : 2IWW et 4LSF.

La structure de la porine OmpF d’Escherichia coli (Fig. 13), résolue en complexe avec trois β-lactamines présentant des états de charge différents (l’ampicilline qui est un zwittérion, la carbénicilline et l’ertapénème qui sont respectivement des antibiotiques di- anionique et anionique), a notamment permis de mieux comprendre le mécanisme d'import. Les simulations de translocation réalisées par dynamique moléculaire ont permis de montrer que la nature de ces antibiotiques affecte la fixation et la vitesse de translocation, mais qu’elle n’affecte pas la diffusion à travers la porine (Ziervogel & Roux, 2013).

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Figure 13 : Structure d’un monomère de la porine OmpF d’Escherichia coli en complexe avec différentes β- lactamines (A). Les sites de fixation des antibiotiques sont représentés par superposition à la structure du

monomère d’OmpF, des positions de l’ampicilline (en vert), de la carbénicilline (en bleu) et de l’ertapénème (en violet) au sein de la structure d’OmpF. Vue de l’extrémité extracellulaire du monomère. (B) en complexe avec l’ampicilline (code PDB 4GCP). (C) en complexe avec la carbénicilline (code PDB 4GCQ). (D) en complexe avec l’ertapénème (code PDB 4GCS). Les trois antibiotiques présentent des sites de fixation et des conformations différents malgré leur appartenance à la même famille, montrant ainsi que les porines permettent l’entrée par diffusion dans la cellule de molécules variées. Les boucles L2 et L3 sont indiquées. EC : extrémité extracellulaire.

A

B

C

D

Ampicilline Carbénicilline Ertapénème

L2 L3

22 La pression de sélection exercée par les antibiotiques favorise l’apparition de mutations au sein des gènes codant pour des porines mais également au sein des gènes régulateurs de leur expression, entraînant ainsi une répression de l’expression de ces porines ainsi que leur substitution par des canaux sélectifs, capables de limiter l’entrée des antibiotiques à l’intérieur des cellules (Tamber & Hancock, 2003 ; Blair & al, 2015). Le diamètre de la zone de constriction de la porine spécifique des maltodextrines LamB d’Escherichia coli, est réduit à 50 Å par la présence de 2 boucles supplémentaires à l’intérieur du tonneau, limitant ainsi l’accès de molécules de plus grande taille. Les facteurs qui régissent la sélectivité des porines impliquent donc la répulsion de charges, la taille et l’hydrophobicité (Cox & Wright, 2013).

Ce mécanisme est de plus en plus impliqué dans la résistance à de nouveaux antibiotiques tels que les carbapénèmes et les céphalosporines, qui sont généralement pris en charge par des enzymes de dégradation (Blair & al, 2015).

2.2.1.2. Augmentation de l’efflux

Les pompes à efflux sont des systèmes de transporteurs membranaires impliqués dans l’efflux actif des antibiotiques vers le milieu extracellulaire. Elles sont naturellement produites par les bactéries et sont impliquées dans la résistance naturelle.

L’expression de la plupart de ces pompes est régulée par des répresseurs spécifiques (MarR pour la pompe AcrAB-TolC chez Escherichia coli, MexZ et MexR pour les pompes MexXY-OprM et MexAB-OprM chez Pseudomonas aeruginosa, MtrR pour la pompe MtrCDE chez Neisseria gonorrhoeae) (Grkovic & al, 2006). L’introduction de mutations au sein de ces gènes régulateurs entraîne une levée de l’inhibition, conduisant ainsi à la surproduction des pompes à efflux (Nikaido, 2009) (Fig. 14).

Chez Escherichia coli, l’expression de la pompe AcrAB-TolC est régulée par un répresseur de la famille TetR. L’inhibition du répresseur peut être levée par des facteurs de transcription de la famille AraC, dont l’expression est régulée par des répresseurs de la famille MarR. Cette famille de répresseurs contrôle la production de facteurs de virulence, la

23 réponse aux antibiotiques et au stress oxydatif et le catabolisme des composés aromatiques environnementaux. Des mutations au sein des gènes codant pour des répresseurs de type TetR ou MarR entraînent une levée de l’inhibition et par conséquent une surexpression de la pompe AcrAB-TolC.

Figure 14 : Régulation de l’expression des pompes à efflux. L’expression des gènes codant pour des pompes à

efflux est contrôlée par des gènes régulateurs locaux situés à proximité de ces gènes (de type TetR) et des régulateurs dits globaux. Ces régulateurs globaux incluent les facteurs de transcription (de type AraC) dont l’expression est régulée par un répresseur (MarR chez Escherichia coli) (a). Des mutations au sein de gènes codant pour des répresseurs, des facteurs de transcription ou des séquences intergéniques peuvent entraîner une surexpression des pompes à efflux (b, c), elle peut également être un résultat de l’induction en réponse à des signaux environnementaux tels que la fixation d’une molécule à un répresseur, réduisant ainsi son affinité pour son gène cible (d). Les voies activées sont indiquées par les flèches pleines et les voies inhibées par des flèches en pointillés. (Adapté de Blair & al, 2015, Nature Review Microbiology).

24 Certaines pompes à efflux sont spécifiques d’une famille d’antibiotiques donnée mais la plupart d’entre elles sont beaucoup moins spécifiques et transportent une large gamme de molécules. C’est le cas du transporteur AcrB d’Escherichia coli qui transporte aussi bien des colorants, des détergents que des solvants (Nikaido, 2009). La surexpression de ces pompes, observée notamment chez des isolats cliniques multirésistants (Poole, 2005) entraîne donc une augmentation de la résistance aux antibiotiques habituellement utilisés en antibiothérapie. Cette résistance est d’autant plus importante que certains des gènes codant pour ces pompes sont portés par des éléments mobiles, notamment des plasmides qui peuvent être transférés d’une bactérie à l’autre, contribuant ainsi à une propagation rapide de la résistance.

Le plasmide portant les gènes codant pour la pompe à efflux OqxAB, impliquée dans la résistance aux quinolones, est de plus en plus présent chez la plupart des Entérobactéries. Ces gènes, normalement portés par le chromosome bactérien, ne confèrent pas de résistance aux quinolones, sauf chez les bactéries du genre Klebsiella pneumoniae auxquelles ils confèrent une résistance à l’olaquindox (additif alimentaire aux propriétés antibactériennes utilisé dans les élevages), au chloramphénicol et aux quinolones. La transposition de l’opéron chromosomal au plasmide contribue à augmenter la capacité de résistance de façon significative (d’un facteur 80). L’augmentation de la résistance des Entérobactéries aux fluoroquinolones médiée par la pompe à efflux OqxAB semble donc liée à la dissémination de ce plasmide (Wong & al, 2015).

Il existe plusieurs systèmes membranaires impliqués dans l’efflux et répartis en cinq familles (Fig. 15) en fonction de la source d’énergie, de la nature des substrats et du type d’ancrage à la membrane:

la famille ABC (ATP-Binding Cassette) qui utilise l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour le transport des molécules,

les familles MFS (Major Facilitator Superfamily), SMR (Small Multidrug Resistance), MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion) et RND (Resistance-Nodulation- Division) qui couplent l’efflux des molécules à un gradient membranaire d’ions sodium ou de protons, utilisé comme source d’énergie.

25 Les transporteurs de la famille RND (qui seront décrits de façon plus exhaustive au paragraphe 4) sont des complexes tripartites insérés dans les deux membranes (externe et interne) et sont par conséquent spécifiques des bactéries Gram négatif. Les autres familles de transporteurs sont insérées uniquement dans la membrane interne (ou cytoplasmique chez les bactéries Gram positif) et sont donc présentes chez tous les types bactériens. Une sixième famille, la famille PACE (Proteobacterial Antimicrobial Compound Efflux), homologue de la famille de transporteurs RND, a récemment été décrite pour son implication dans l’efflux actif (Hassan & al, 2015 ; Hassan, Elbourne, & al, 2015).

Figure 15 : Les différents systèmes d’efflux bactériens.

2.2.2. La modification de la cible

Un autre système de résistance passe par la modification de la cible. En effet, pour être efficace, un antibiotique doit pouvoir interagir avec sa cible. Les bactéries sont cependant capables de développer des résistances en incorporant des mutations au sein de gènes codant pour des protéines cibles, empêchent ainsi l’interaction avec l’antibiotique tout en conservant une protéine fonctionnelle.

26 C’est le cas de la résistance aux fluoroquinolones (§ 1.2.3), qui est liée à la mutation des enzymes cibles, les topoisomérases. Chez Mycobacterium tuberculosis, la résistance liée à la mutation de la gyrase GyrA est due à la substitution de certains résidus tels que la glycine 83 remplacée par une alanine ou encore de l’aspartate 94 remplacé par une asparagine, une alanine ou une glycine ( Aubry & al, 2006 ; Matrat & al, 2008). Ces modifications semblent minimes mais elles sont suffisantes pour modifier la conformation de l’enzyme, empêchant ainsi la fixation de l’antibiotique tout en conservant une protéine fonctionnelle (Piton & al, 2010) (Fig. 16).

Figure 16 : Représentation du site actif de l’ADN gyrase de Mycobacterium tuberculosis en complexe avec une quinolone. Contrairement à la forme sauvage de l’enzyme (en vert, à gauche, code PDB 5BS8), la forme

mutée (en vert à droite, code PDB 3IFZ), retrouvée chez les souches résistantes aux quinolones présente une extrémité N-terminale structurée en hélice (en rose). Le modèle décrit sur la base de la structure de l’enzyme mutée montre que cette hélice occupe la poche de fixation des quinolones (en jaune) au sein du dimère, provoquant ainsi un encombrement stérique avec l’ADN substrat (en orange) et l’antibiotique (en jaune). (Adapté de Piton & al, 2010, PLoS One).

27 La résistance par modification de la cible passe également par la surexpression de certains gènes régulateurs qui contribuent à protéger les cibles de l’action des antibiotiques. Chez E. coli, la protéine de signalisation PmrD est surexprimée en réponse à des signaux environnementaux, inhibant ainsi la déphosphorylation de la protéine régulatrice PmrA par la protéine senseur PmrB. Les gènes régulés par PmrA et PmrB, codant pour des enzymes de modification du lipide A (LPS), notamment ArnT et EptA, sont par conséquent exprimés de façon continue et constitutive, conduisant à une modification du LPS par addition de groupements tels que le 4-amino-4-desoxy-L-arabinose (L-Ara4N) ou le phosphoethanolamine (pEtN) (Fig. 17). Ces groupements réduisent la charge négative nette du LPS, minimisant la fixation des antibiotiques cationiques, rendant ainsi la bactérie résistante, notamment aux polymyxines (§ 1.2.1.2) (Rubin & al, 2015).

Figure 17 : Modification du LPS et résistance aux polymyxines. Les enzymes ArnT et EptA modifient le LPS en

additionnant des groupements tels que le 4-amino-4-desoxy-L-arabinose (L-Ara4N) ou le phosphoethanolamine (pEtN), empêchant ainsi l’interaction avec les polymyxines. (Adapté de Rubin & al, 2015, Antimicrobial Agents and Chemotherapy).

28 Les bactéries peuvent également acquérir des gènes homologues à la cible de l’antibiotique. C’est le cas des souches de Staphylococcus aureus résistantes à une β- lactamine, la méthicilline (SARM). Cette résistance est due à l’acquisition d’une cassette chromosomique SCCmec portant le gène mecA. Ce gène code pour une protéine additionnelle (PLP2a), ayant une faible affinité pour les β-lactamines et étant donc capable de se substituer aux PLPs natives, inhibées en présence d’antibiotiques (Katayama, Ito, & Hiramatsu, 2000). Elle permet ainsi une résistance croisée aux antibiotiques de la famille des β-lactamines.

2.2.3. La modification ou la dégradation de l’antibiotique

L’inactivation des antibiotiques par des enzymes constitue le mécanisme de résistance naturel le plus répandu. Cette inactivation peut s’effectuer par hydrolyse ou par addition d’un groupement chimique (phosphorylation, acétylation, adénylation), empêchant ainsi l’interaction de l’antibiotique avec sa cible. Ces enzymes d’inactivation sont naturellement produites par les bactéries. Néanmoins, des copies supplémentaires des gènes les codant peuvent être apportées par des plasmides, conférant ainsi une résistance accrue ou un élargissement du spectre d’activité des bactéries qui les portent.

2.2.3.1. Inactivation par hydrolyse enzymatique

Les β-lactamases sont les hydrolases les plus répandues et les plus importantes dans la résistance aux antibiotiques des souches cliniques. Elles hydrolysent le noyau β-lactame des β-lactamines et sont classées en différentes sous-familles en fonction de la classe de β- lactamines hydrolysées (pénicillinases, céphalosporinases, carbapénémases, etc.) et du mécanisme d’hydrolyse (Sérine β-lactamases et métallo-β-lactamases) résumé par la Figure 18.

29 Les β-Lactamases sont naturellement produites par les bactéries, mais le développement de nouveaux antibiotiques ayant une meilleure affinité pour leurs substrats a cependant entraîné l’émergence de nouvelles β-lactamases possédant un spectre d’activité beaucoup plus large, les BLSE (β-Lactamases à Spectre Etendu) (Jacoby & Medeiros, 1991). Les BLSE (pour la plupart dérivées des β-Lactamases des familles SHV ou TEM) sont capables d’hydrolyser les β-lactamines de seconde, de troisième et parfois de quatrième génération (carbapénèmes, céphalosporines) et leur présence chez les bactéries Gram négatif telles que Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et les bactéries du genre Acinetobacter contribuent à l’apparition de nouvelles souches résistantes à la majorité, voire à toutes les β-lactamines (Bush & Fisher, 2011). La plupart des plasmides portant les gènes codant pour des BLSE portent également des gènes de résistance aux aminoglycosides et au triméthoprime (Jin & al, 2014 ; Xia & al, 2016), ce qui contribue à une résistance croisée avec d’autres familles d’antibiotiques.

Figure 18 : Mécanisme d’action général des Sérine et des métallo-β-lactamases. (Wright, 2011, Chemical

30 L’augmentation de la résistance aux β-lactamines résulte d’une part du transfert des gènes codant pour des β-lactamases, initialement porté par le chromosome bactérien, aux plasmides, augmentant ainsi le nombre de copies des gènes et contribuant de ce fait à la surexpression de ces enzymes. Elle résulte d’autre part de mutations au sein de gènes codant pour ces enzymes (TEM, SHV) et du transfert de plasmides (et donc de gènes de résistance) d’une bactérie à une autre. Chez E. coli, le niveau d’expression basal de la β- lactamase AmpC est faible et ce gène est inexistant au niveau du chromosome des bactéries du genre Klebsiella et Salmonella. Mais la présence de plasmides porteurs de gènes codant pour cette β-lactamase entraîne une augmentation de la résistance similaire à celle observée chez des souches mutantes d’Enterobacter cloacae résistantes aux céphalosporines (Xia & al, 2016).

En plus des BLSE dérivées des familles SHV ou TEM, il existe d’autres familles d’enzymes impliquées dans la résistance aux β-lactamines. Elles agissent principalement contre les oxyimino-β-lactamines (Bush & Fisher, 2011) et les plus répandues sont :

les β-lactamases AmpC à spectre étendu (ESAC), qui hydrolysent la plupart des céphalosporines. Cependant elles hydrolysent peu les nouveaux carbapénèmes (ertapénème et doripénème) et les céphalosporines zwittérioniques (céfépime) pour lesquels leur affinité est faible,

les BLSE de la famille CTX-M (CTX-M14 et CTX-M15) qui dérivent de bactéries environnementales non pathogènes du genre Kluyvera et qui hydrolysent majoritairement la céfotaxime par rapport aux autres oxyimino β-lactamines,

les sérines β-lactamases (KPC) et les métallo- β-lactamases (VIM, IMP et les enzymes de la famille NDM) qui hydrolysent principalement les carbapénèmes.

2.2.3.2. Inactivation par addition d’un groupement chimique

L’addition de groupements chimiques aux antibiotiques par les enzymes bactériennes entraîne un encombrement stérique qui empêche la fixation de l’antibiotique à sa cible. Différents groupements chimiques peuvent être ajoutés aux antibiotiques (acyle, phosphate,

31 nucléotidyl). Les aminoglycosides constituent des cibles de choix pour les enzymes de modification à cause de l’accessibilité des groupements hydrophiles (hydroxyle, amide) de ces antibiotiques polycationiques.

Les enzymes de modification sont regroupées en trois catégories : les acyltransférases (voir § 3.2.2.2 pour celles de Pseudomonas), les phosphoryltransférases et les nucléotidyltransférases. Ces enzymes confèrent une résistance élevée aux antibiotiques qu’elles modifient. Elles sont portées par des transposons et se transmettent rapidement d’une bactérie à l’autre. C’est le cas de l’aminoglycoside phosphorylase APH(3’)-I, portée par un plasmide et retrouvée chez 46 % des bactéries Gram négatif résistantes aux aminoglycosides, qui présente des similitudes avec une enzyme dont le gène est porté par le chromosome bactérien de Streptomyces fradiae (Shaw & al, 1993).

Des mutations au sein de gènes codant pour ces enzymes de modification peuvent conduire à une extension du spectre d’activité. Pour exemple, l’aminoglycoside acétyltransférase AAC(6’)-Ib-cr présente des mutations qui lui confère la capacité de modifier les groupements amine du cycle pipérazine des fluoroquinolones (Robicsek & al, 2006). De même, un variant d'AAC(6’)-Ib retrouvé dans des souches cliniques, montre une extension de résistance à la plupart des aminoglycosides, et aux fluoroquinolones, de structure éloignée, de par l'élargissement de son site actif (Maurice & al, 2008).