Etude de l’effet de l’efflux sur l’activité des antibiotiques

Plusieurs études impliquant la délétion des pompes ou encore l’étude de la sensibilité d’isolats cliniques à différents antibiotiques ont permis de sélectionner des mutants résistants surexprimant ces pompes (Masuda & al, 2000 ; Schweizer, 2003 ; Poole, 2000, 2004, 2005 ; Purssell & Poole, 2013). Ces études, réalisées par complémentation in vivo et mesure de concentration minimale inhibitrice (CMI) ont permis de montrer que la sensibilité de P. aeruginosa à plusieurs antibiotiques a été restaurée grâce la délétion de l’une ou l’autre des quatre pompes précédemment citées (Morita & al, 2001). La plupart des antibiotiques sont des composés amphiphiles avec des domaines hydrophobes, on observe

102 cependant des différences notables au cours de l’efflux, y compris au sein d’une même classe d’antibiotiques (Yu & al, 2003 ; Delcour, 2009 ; Brown & al, 2014). La tigécycline, qui a été développée sur la base de la structure de la tétracycline, est un antibiotique qui n’est pas substrat des pompes de la famille MFS, mais qui reste un substrat des pompes de la famille RND (MexY, MexB et MexD) chez P. aeruginosa (Dean & al, 2003 ; Visalli & al, 2003). Ce résultat illustre la flexibilité des pompes.

Cependant, la capacité des pompes à exporter un antibiotique donné n’est pas la même pour tous les antibiotiques appartenant à la même famille. Plusieurs auteurs ont montré que certaines pompes à efflux présentent une préférence pour les quinolones et que l’efflux s’effectue avec une différence de spécificité suivant la nature des quinolones. Les fluoroquinolones telles que la ciprofloxacine ou la norfloxacine sont exportées de façon efficace par les pompes MexEF-OprN et MexCD-OprJ, leur efflux par les pompes MexAB- OprM ou MexXY-OprM étant beaucoup moins efficace (Fig. 57). Les quinolones non fluorées telles que l’acide nalidixique (Fig. 57) sont quant à elles préférentiellement exportées par la pompe MexEF-OprN, beaucoup moins par les pompes MexAB-OprM et MexCD-OprJ et très peu par la pompe MexXY-OprM (Köhler & al, 1997 ; Masuda & al, 2000). Ces résultats ont permis de conclure que la pompe MexCD-OprJ reconnaît spécifiquement les fluoroquinolones portant une charge positive et un atome de fluor, tandis que les quinolones dépourvues d’atome de fluor sont préférentiellement reconnues par la pompe MexEF-OprN.

Figure 57 : Structures d’une quinolone fluorée (fluoroquinolone) (A) et d’une quinolone non fluorée (B).

L’atome de fluor est encerclé en rouge.

Ciprofloxacine Acide nalidixique

B

A

103 Des études de l’efflux des β-lactamines, initialement réalisées avec AcrB chez Salmonella Typhi et transposées chez P. aeruginosa ont permis de montrer que le caractère hydrophobe de la chaîne latérale de ces antibiotiques constitue également un critère de sélection. Ces études ont permis de montrer que, plus la chaîne latérale est hydrophobe, plus l’antibiotique est susceptible d’être substrat des pompes (Masuda & al, 2000, 2001 ;Hocquet & al, 2006 ; Baum & al, 2009).

MexB transporte un large éventail de β-lactamines (pénicillines, carbapénèmes) mais l’imipénème n’est pas un substrat de la pompe. MexD a un spectre d’activité plus étroit et n’efflue aucun des substrats de MexB. MexY a un spectre encore plus étroit, excluant notamment la cefsulodine et l’aztréonam. Ces études ont permis de montrer que les substrats chargés négativement sont préférentiellement reconnus par MexB, mais pas par MexD ni par MexY. Le rôle des résidus chargés a été démontré grâce à des mutants de MexD présentant une capacité d’interaction avec des β-lactamines négativement chargées (ceftazidime, aztréonam). Les mutants Q45K et E89K présentent en effet une lysine additionnelle qui confèrent une résistance à ces antibiotiques (Mao & al, 2002) contrairement à la forme sauvage.

Ces études ont également permis de montrer que les pompes présentent une différence de spécificité pour les carbapénèmes suivant leur nature. Les pompes MexAB- OprM et MexXY-OprM sont surexprimées chez des isolats cliniques de P. aeruginosa résistantes au méropénème, tandis que la sensibilité à l’imipénème demeure. La pompe MexEF-OprN n’est pas surexprimée et la pompe MexCD-OprJ est encore moins exprimée (Masuda & al, 2000 ; Ong & al, 2007 ; Castanheira & al, 2014). La différence réside essentiellement dans la nature et la flexibilité de la chaîne latérale, le méropénème ayant une chaîne latérale rigide et hydrophobe et la chaîne latérale de l’imipénème étant plus flexible et hydrophile (Fig. 58). Cette différence constitue donc un outil intéressant pour une étude comparative de l’interaction des pompes à efflux avec les carbapénèmes.

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Figure 58 : Structures de deux carbapénèmes. L’imipénème présente une chaîne latérale hydrophile et flexible

tandis que le méropénème présente une chaîne latérale rigide et hydrophobe.

Les mesures de CMI sont cependant dépendantes de la concentration minimale nécessaire pour activer un efflux maximal, ce qui complique les mesures chez P. aeruginosa, notamment à cause de sa faible perméabilité membranaire (voir § 2.2.1). Ceci limite l’accès des antibiotiques, élevant ainsi la CMI à des valeurs supérieures aux concentrations nécessaires pour tuer la bactérie (Dreier & Ruggerone, 2015). Dans ce cas, des inhibiteurs de l’efflux sont utilisés pour déterminer de façon rapide et précise si une molécule est un substrat des pompes ou pas. Les mesures de CMI en présence de phénylalanine-arginine β- naphthylamide (PAβN) ou de carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) sont classiquement réalisées pour analyser l’effet de l’efflux. Le PAβN inhibe les pompes à efflux et perméabilise les membranes. La réduction de la CMI d’un antibiotique en présence de PaβN indique que cet antibiotique est substrat de la pompe testée (Mesaros & al, 2007 ; Tran & al, 2009 ; Castanheira & al, 2014). Le CCCP est un inhibiteur indirect de l’activité d’efflux. Il dissipe la force protomotrice inhibant ainsi l’activité d’efflux des pompes de la famille RND. Il est utilisé de façon identique au PAβN. Ces tests de sensibilité permettent de déterminer de façon générale si une molécule est ou non substrat des pompes mais ils ne permettent cependant pas de déterminer les mécanismes d’interaction et d’efflux.

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