Etude des interactions au sein de la pompe

Les études d’interaction ont été majoritairement réalisées grâce à la pompe AcrAB- TolC d’E. coli. Quelques données existent néanmoins concernant l’interaction au sein des pompes MexAB-OprM, MexXY-OprM, et MexEF-OprN de P. aeruginosa. Les études d’interaction portent sur l’interaction des pompes avec leurs substrats mais également sur l’interaction entre les différents partenaires des pompes. Elles ont été réalisées aussi bien par des approches biochimiques telles que l’ITC, la SPR, la fluorimétrie que par des

108 approches de microbiologie et de biologie moléculaire (mutagénèse dirigée, complémentation) ou encore par des approches structurales. La description faite ici n’est donc pas exhaustive.

5.3.1. Etude des interactions avec les substrats

Des études d’interaction ou de compétition d’AcrB en solution ou immobilisée sur une surface, avec des substrats fluorescents (rhodamine 6G, BET, proflavine) ou non (ciprofloxacine, novobiocine, PAβN) ont permis de montrer des différences d’affinité suivant la nature du substrat, mais également la présence de différents sites de fixation en fonction du type de substrat (Murakami & al, 2006 ; Su & al, 2007 ; Tikhonova & al, 2011 ; Nakashima & al, 2011 ; Eicher & al, 2012). Ces études ont ainsi permis de confirmer la spécificité de l’interaction des pompes avec leurs substrats ou leurs inhibiteurs (Vargiu & Nikaido, 2012 ; Vargiu & al, 2014). Plusieurs molécules ont été décrites in vivo comme étant des substrats des pompes mais seules quelques-unes d’entre elles ont pu être cristallisées en complexe avec le transporteur (Murakami & al, 2006 ; Seeger & al, 2006 ; Sennhauser & al, 2007, 2009 ; Nakashima & al, 2011 ; Eicher & al, 2012).

L’analyse de ces structures a permis de montrer l’importance des domaines de fixation des substrats (essentiellement localisées au niveau du domaine périplasmique, voir § 3.1.1.1 et 3.1.1.2) dans la spécificité d’interaction avec ceux-ci. Murakami et al ((Murakami & al, 2006) ont notamment montré que les substrats de faible poids moléculaire (doxorubicine, minocycline) se fixent préférentiellement au niveau de la poche distale de la crevasse tandis que Nakashima & al et Eicher et & al (Nakashima & al, 2011 ; Eicher & al, 2012) ont montré que les substrats de haut poids moléculaire (érythromycine) se fixent préférentiellement au niveau de la poche proximale de la crevasse (voir § 3.1.1.2).

La permutation de gènes codant pour des boucles périplasmiques entre AcrB et AcrD chez E. coli, MexB et MexY chez P. aeruginosa, et AcrB d’ E. coli et MexB de P. aeruginosa ont permis de montrer que la spécificité de reconnaissance du substrat est altérée (Elkins & Nikaido, 2002 ; Tikhonova & al, 2002 ; Eda & al, 2003, Wehmeier & al, 2009). Ces résultats

109 ont été confirmés par des expériences de mutagénèse dirigée au niveau des boucles périplasmiques de MexB et MexD (Mao & al, 2002 ; Middlemiss & Poole, 2004) ou de permutation de gènes entre MexB et MexY. Les mutations Q34K, E89K et N67K de MexD permettent l’efflux de β-lactamines chargées négativement, qui ne sont pourtant pas des substrats de la forme sauvage du transporteur, tandis que la permutation des domaines périplasmiques de MexB et MexY permet la reconnaissance et la fixation des β-lactamines anioniques qui ne sont pourtant pas substrats de MexY (Mao & al, 2002). Par ailleurs, les mutations des résidus D133 et Y613 de MexY affectent la résistance aux aminoglycosides (Lau & al, 2014).

Ces études ont par ailleurs permis de caractériser les voies d’entrée des substrats (Husain & al, 2011 ; Yao & al, 2013 ; Nakashima & al, 2013) ainsi que les poches de fixation, notamment la poche de fixation (poche hydrophobe comprise entre les domaines PC1 et PC2, voir § 4.1.1.2) des résidus à l’intérieur de la cavité distale d’AcrB d’E. coli et de MexB de P. aeruginosa (Murakami & al, 2006 ; Nakashima & al, 2011 ; Eicher & al, 2012). Un résidu Asparagine a notamment été identifié comme étant le résidu de la poche hydrophobe qui permet l’interaction avec les macrolides chez MexB de P. aeruginosa (Wehmeier & al, 2009). La permutation de gènes et des expériences de mutagénèse dirigée ont également permis de montrer que la spécificité d’une pompe est liée à la présence de résidus spécifiques au niveau des poches de fixation (Dreier & Ruggerone, 2015). On note la présence d’un tryptophane au niveau de la poche de fixation chez MexY, résidu qui est absent chez MexB et qui par conséquent ne peut pas contribuer à la spécificité de la pompe. Quatre résidus (Asp410, Ala411, Glu417 et Lys951) ont été identifiés par mutagénèse dirigée au niveau du domaine transmembranaire de MexF comme étant nécessaires à l’activité du transporteur. La mutation d’un cinquième résidu (Glu349) empêche l’efflux du triméthoprime mais une activité partielle persiste en présence de chloramphénicol (Aires & al, 2002).

5.3.2. Etude des interactions entre les partenaires de la pompe

La spécificité de substrat est médiée par le transporteur RND. Des expériences de complémentation et de fluorescence ont permis de montrer que l’érythromycine, qui est un

110 substrat de la pompe MexCD-OprJ et qui n’est pas substrat de la pompe MexAB-OprM, est accumulé dans les cellules en présence de la pompe chimérique MexC-MexB-OprJ dans laquelle le transporteur MexD est remplacé par le transporteur MexB (Murata & al, 2002). Ces résultats sont corroborés par le fait que les pompes chimériques MexC-MexD-OprM et MexE-MexF-OprM au sein desquelles le canal OprM remplace respectivement OprJ et OprN, restaurent la résistance aux fluoroquinolones, qui sont des substrats des pompes MexE- MexF-OprN et MexC-MexD-OprJ mais pas à la ceftazidime et à l’aztréonam qui sont des substrats de la pompe MexA-MexB-OprM (Gotoh & al, 1998 ; Maseda & al, 2000).

Ces résultats montrent également le caractère versatile de certains canaux tels qu’OprM ou encore TolC d’E. coli. Ces canaux sont en effet capables de se substituer aux canaux de certaines pompes (OprN, OprJ) tout en conservant une pompe fonctionnelle (Srikumar & al, 1998 ; Maseda & al, 2000 ; Bokma & al, 2006). Cette caractéristique ne semble cependant pas être commune à toutes les OMFs car si OprJ se substitue à OprM au sein de la pompe MexAB, OprN ne se substitue pas à OprM, la pompe chimérique MexA- MexB-OprN n’étant pas fonctionnelle (Yoneyama & al, 1998 ; Maseda & al, 2000). Des mutants gain de fonction ont par ailleurs permis de montrer que l’extrémité C-terminale d’OprM est indispensable pour sa stabilité et l’assemblage au sein de la pompe (Bai & al, 2010 ; 2014).

Le rôle de la MFP dans l’assemblage a été décrit précédemment, des expériences de co-purification des constituants OMF, RND et MFP des pompes MexAB-OprM et MexXY- OprM ont permis de montrer l’interaction entre le transporteur RND et la MFP est spécifique car MexX et OprM ne sont pas co-purifiés en présence de MexB, ce qui est également le cas pour MexA et OprM en présence de MexY. De plus, les pompes chimériques MexA-MexD- OprM et MexC-MexB-OprM ne sont pas fonctionnelles, ce qui va dans le sens des résultats précédents (Yoneyama & al, 1998 ; Mokhonov & al, 2004). Les résidus qui empêchent l’oligomérisation de MexA et son interaction avec MexB ont d’ailleurs été identifiés grâce à des expériences de mutagénèse dirigée (Nehme & al, 2004). Les gènes codant pour certaines pompes à efflux sont portés par des opérons dépourvus de gènes codant pour le canal OMF. Ces pompes, à l’instar de la pompe MexXY ou encore de la pompe MexJK recrute plusieurs transporteurs suivant la nature du substrat efflué (Jo & al, 2003 ; Chuanchuen & al, 2005).

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L’implication des pompes à efflux de la famille RND dans l’augmentation sans cesse croissance de la résistance aux antibiotiques, en fait des cibles d’intérêt pour le développement de nouvelles molécules permettant de restaurer l’efficacité des molécules thérapeutiques préexistantes. Plusieurs inhibiteurs de pompes d’efflux ont été développés mais ils présentent l’inconvénient d’être toxiques. Les données expérimentales liées à la structure et à l’activité de ces pompes restent cependant trop peu nombreuses pour pouvoir mettre en place les différentes stratégies visant à développer de nouveaux inhibiteurs, notamment des molécules capables de bloquer le canal OMF, de dissiper la force protomotrice, d’empêcher l’assemblage ou encore d’inhiber les pompes de façon compétitive. La compréhension des mécanismes qui régulent l’expression, l’assemblage et le fonctionnement des pompes mais également les interactions et les fonctions des composants OMF, RND et MFP au sein de la pompe tripartite permettront donc à terme de développer des inhibiteurs efficaces de l’activité de ces pompes à efflux. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d’ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nous avons par ailleurs participé à l’étude in vitro de l’assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes. En parallèle de l ‘étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire hospitalo-universitaire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la β-lactamase AmpC de P. aeruginosa.