3.2 Essais enzymatiques : détermination de résidus catalytiques
3.2.2 Résidus impliqués dans la spécificité α/β
En sus de ces résidus catalytiques nucléophile-base, nous avons également identifié dans la séquence de CaBmt3 six résidus qui pourraient être impliqués dans
115
la spécificité de substrat. Afin de déterminer leur fonction, nous avons décidé de remplacer ces résidus par ceux qui sont retrouvés conservés dans les séquences des enzymes d’initiation CaBmt1, 2, 5 et 9. Par exemple, en reprenant la figure 48, nous avons identifié dans le rectangle continu noir la présence de résidus valine ou isoleucine dans les séquences des enzymes d’initiation, alors que dans les autres séquences, ils sont remplacés par des résidus proline ou alanine. En l’occurrence, pour CaBmt3, il s’agit de l’Ala257. Le but ici va donc être de muter cette Ala257 en Ile257
telle qu’elle est retrouvée chez CaBmt1. Ce faisant, nous espérons ainsi changer la spécificité de CaBmt3 d’un substrat possédant, à son extrémité non réductrice, un β- 1,2 mannose, à un substrat possédant un α-1,2 mannose. Conscients de la difficulté d’un tel changement, nous avons également choisi de réaliser des mutations multiples (quintuple et sextuple mutants) en plus des six mutants simples.
Au final, nous avons donc produit chez E. coli les mutants suivants : K176H, C178I, A257I, H403A, E481R, K487D, 5M (quintuple mutant comprenant toutes les mutations sauf K487D) et 6M (sextuple mutant comprenant toutes les mutations) (Figure 55).
Figure 55 : Expression chez E. coli des mutants simples et multiples de la spécificité de substrat de CaBmt3.
Electrophorèse SDS/PAGE, coloration au bleu de Coomassie.
5M : quintuple mutant (K176H/C178I/A257I/H403A/E481R).
6M : sextuple mutant (K176H/C178I/A257I/H403A/E481R/K487D).
116
Leur présence dans le lysat cellulaire a été confirmée par western blot grâce à un anticorps polyclonal anti-Bmt3 dirigé contre une séquence présente au niveau du domaine catalytique C-terminal (mais non concernée par les mutations) (Figure 56).
Une fois à disposition, l’activité enzymatique de ces mutants de Bmt3 a été analysée en présence du substrat DP3M-a (Manα1-2Manα1-2Man-Mantyl). Si la mutation insérée n’a pas d’effet sur la spécificité de substrat, l’enzyme mutée ne sera pas capable d’utiliser ce substrat dépourvu d’un mannose lié en β-1,2 à son extrémité non réductrice. En revanche, si l’enzyme mutée est capable de former un produit de DP supérieur et porteur d’un mannose lié en β-1,2 à son extrémité non réductrice, alors nous aurons réussi à modifier la spécificité de substrat de l’enzyme Bmt3.
Figure 56 : Expression chez E. coli des mutants simples et multiples de la spécificité de substrat de CaBmt3. Détection dans le lysat cellulaire par western blot grâce à un anticorps anti-Bmt3.
Les réactions ont été effectuées en conditions standards, pendant 48h. La quantité de chaque enzyme mutée introduite dans son milieu réactionnel a été normalisée par densitométrie, comme décrit précédemment. Les résultats ont été obtenus par mesure de l’intensité de fluorescence par HPLC-Fluo.
117
Il apparaît très clairement qu’aucune enzyme mutée n’est parvenue à utiliser le DP3M-a comme substrat accepteur. Aucun signal de DP supérieur n’est visible sur les chromatogrammes (Figure 57). Le seul signal visible est celui du substrat accepteur DP3M-a.
Pour essayer d’aller un peu plus loin dans l’exploitation de ces mutants de la spécificité de substrat α/β, nous avons voulu observer leur réaction sur le substrat accepteur DP4M-b (Manβ1-2Manα1-2Manα1-2Man-Mantyl), substrat optimal de la forme Bmt3 non mutée.
Figure 57 : Réactions enzymatiques des mutants simples, 5M et 6M de la spécificité de substrat α/β sur le substrat accepteur DP3M-a. Après 48h d’incubation en conditions standards, aucun signal de DP supérieur n’est observé. La courbe noire représente la composition du milieu réactionnel à t0.
Les activités enzymatiques ont été suivies par HPLC-Fluo et comparées à celles obtenues pour Bmt1, Bmt3 et la β-galactosidase (contrôle négatif) (Figure 58). Nous pouvons voir qu’après 1h d’incubation, Bmt1 n’a été capable de transformer qu’une infime partie du substrat accepteur en produit de DP supérieur (profil quasiment identique à celui retrouvé pour le t0 et le contrôle négatif). Bien que Bmt1 soit capable in vitro de catalyser le transfert d’un deuxième résidu β-1,2-mannosyle, nous avons vu
qu’il fallait au moins 24h pour commencer à observer un signal chromatographique correspondant. Il est donc normal d’observer moins de 1% de substrat consommé par Bmt1 au bout d’1h. De même, Bmt3 présente un profil d’activité conforme à ce qui a
118
été décrit précédemment, à savoir une consommation quasi-complète (90%) du substrat accepteur.
Observons maintenant les profils d’activité des mutants simples. Le mutant K176H, et dans une moindre mesure C178I, présente un profil similaire à celui de Bmt3. Ceci veut donc dire que les résidus Lys176 et Cys178 ne semblent pas avoir
d’importance particulière ni dans le mécanisme catalytique de Bmt3, ni dans son repliement. Ils peuvent en revanche nous servir éventuellement de contrôle de notre protocole de mutagénèse dirigée, confirmant que le protocole en lui-même n’a pas d’impact notable sur l’activité de l’enzyme mutée qui en résulte. Les effets ainsi observés sont donc uniquement imputables à la présence de la mutation.
Figure 58 : Activités enzymatiques des mutants de Bmt3 simples, 5M et 6M de la spécificité de substrat α/β sur le substrat accepteur DP4M-b après 1h d'incubation en conditions standards. Le contrôle négatif a été effectué grâce à la β-galactosidase, le t0 grâce à l’enzyme Bmt3. Les réactions ont été suivies par détection de fluorescence par
HPLC-Fluo. S : substrat consommé. P : produit formé.
Pour ce qui est des autres mutants simples, A257I, H403A, E481R et K487D, leur profil d’activité n’est pas complétement nul comme il peut l’être pour Bmt1 ou le contrôle négatif, mais nous observons cependant une nette baisse de l’activité enzymatique. Le substrat accepteur n’est ainsi consommé qu’à 5-10%. Le placement
In
te
n
si
té
d
e
f
lu
o
re
sc
e
n
c
e
(
%
)
t0 Bm t1 Bm t3 Con trôle nég atif K17 6H C17 8I A25 7I H40 3A E48 1R K48 7D 5M 6M 0 20 40 60 80 100%S
%P
119
de ces résidus sur la modélisation 3D de CaBmt3 obtenue par I-TASSER nous montre qu’ils se trouvent relativement proches du site actif, et donc des résidus catalytiques identifiés dans le chapitre précédent. Ainsi, comme cela a été envisagé pour le résidu Glu277 précédemment, il est possible que la mutation de ces résidus ait entraîné une
perturbation locale du repliement, conduisant à une modification de l’environnement du site actif et donc du bon déroulé du mécanisme catalytique.
Enfin, les mutants multiples 5M et 6M présentent quant à eux des profils d’activité identiques à ceux de Bmt1 et du contrôle négatif, c’est-à-dire que moins de 1% du substrat accepteur a été consommé. L’accumulation des mutations simples, notamment A257I, H403A, E481R et K487D, au sein d’une même forme mutée a dû perturber suffisamment le repliement du site actif pour que l’enzyme perde totalement son activité par rapport à la forme non mutée.
Pour conclure, l’identification in silico de cibles de mutagénèse dirigée par alignement multiple et modélisation prédictive nous a amené à déterminer la contribution de certains résidus à l’activité β-1,2-mannosyltransférasique de CaBmt3. Ainsi, les résidus Glu258, Asp259 et Asp483 semblent être directement impliqués dans le
mécanisme catalytique. Nous n’avons néanmoins pas réussi à mettre en évidence de résidus pouvant être impliqués dans la spécificité de substrat accepteur. Enfin, faute de temps, nous n’avons pas pu commencer l’étude des résidus Tyr208 et Leu495 et leur
éventuelle implication dans l’activité polymérase de CaBmt4 et CaBmt6.