Préparation de l’échantillon

2.2.1.1 Purification sur colonne par chromatographie par affinité

Nous avons démontré que l’expression chez P. pastoris ne nous permet pas d’obtenir des concentrations suffisantes en Bmt3. Pour pallier ce problème, nous avons décidé de produire l’enzyme recombinante dans E. coli, dans la souche d’expression SHuffle, comme décrit précédemment. En effet, la construction plasmidique employée dispose d’une étiquette 6xHis du côté N-terminal, ce qui devrait grandement faciliter la purification et améliorer les rendements par rapport à la forme recombinante produite chez P. pastoris.

Le protocole de purification est légèrement modifié par rapport à celui décrit précédemment. Produite chez E. coli, pour une culture de 100 mL par exemple, nous récupérons environ 5 mL de cellules en suspension contenant la protéine Bmt3 surexprimée. La libération du contenu intracellulaire, par tampon de lyse et ultrasons, révèle une surexpression manifeste de Bmt3 (Figure 42, piste LC). Bien que le tampon de lyse contienne du détergent (DDM à 0.5%), la proportion de protéine surexprimée retrouvée dans la fraction soluble reste faible, comme constaté dans nos premières productions chez E. coli décrites précédemment (Figure 42, piste FS). Le tampon de lyse contient également 10 mM d’imidazole, afin de minimiser le phénomène de reconnaissance non spécifique lors du chargement de l’échantillon sur la colonne HisTrap HP (colonne Nickel-Sépharose, GE Healthcare). De ce fait, nous constatons que la protéine d’intérêt ne se retrouve plus dans la FNR de chargement (Figure 42, piste FNR). Un premier palier d’élution à 25 mM d’imidazole permet d’éliminer les éventuelles protéines endogènes d’E. coli retenues non spécifiquement sur la colonne (Figure 42, piste 25mM). L’élution proprement dite de la protéine d’intérêt est effectuée à 250 mM d’imidazole. Nous constatons que la très grande majorité de l’enzyme est éluée dans deux fractions d’élution, visiblement en très bonnes quantités (Figure 42, pistes 250mM). Un dernier palier d’élution à 500 mM d’imidazole ne décroche aucune protéine supplémentaire (Figure 42, piste 500mM).

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Figure 42 : Purification de Bmt3 exprimée chez E. coli par chromatographie par affinité sur colonne HisTrap. Electrophorèse SDS/PAGE et coloration au bleu de Coomassie. LC : lysat cellulaire, FS : fraction soluble, FNR : fraction non retenue.

2.2.1.2 Détermination du tampon de stabilité

Afin de s’assurer que l’enzyme purifiée reste la plus stable possible, nous avons essayé de déterminer le tampon dans lequel l’enzyme est la plus stable. Pour cela, nous avons utilisé la technique de TSA (Thermal Shift Assay) qui consiste à chauffer progressivement, depuis la température ambiante jusque 95°C, la protéine se trouvant dans divers tampons. A chaque condition est ajouté au préalable un composé fluorescent, le Sypro Orange, qui va se lier de manière non spécifique aux acides aminés hydrophobes de la protéine, normalement difficilement accessibles en solution aqueuse si la protéine est bien conformée (et donc stable). Sous l’effet de la température croissante, la protéine va alors se dénaturer progressivement, exposant ainsi de plus en plus d’acides aminés hydrophobes qui vont donc fixer de plus en plus de Sypro Orange. Plus la protéine se trouve dans un environnement stable (nature du tampon, pH, concentration en sels…), plus la température à laquelle la protéine va commencer à se dénaturer sera élevée. L’analyse de la détection de fluorescence en fonction de la température nous permet ainsi de déterminer le tampon optimal pour la stabilité de notre protéine d’intérêt (Figure 43). En l’occurrence, nous avons dans un premier temps déterminé que la composition du tampon idéal était : Tris 0.1 M à pH 7.5, NaCl 150 mM.

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Figure 43 : Représentation graphique de la fluorescence du Sypro Orange fixé aux acides aminés hydrophobes de Bmt3 en fonction de la température. Chaque courbe représente une condition testée. Les meilleures sont G3 (Bicine 100 mM pH 9, 150 mM NaCl), B2 (Phosphate de sodium 100 mM pH 7.5, NaCl 150 mM) ou encore C2 (Tris/HCl 100 mM pH 7.5, NaCl 150 mM).

2.2.1.3 Chromatographie d’exclusion stérique et concentration

Connaissant la nature du tampon dans lequel notre protéine d’intérêt est la plus stable nous avons utilisé celui-ci afin de réaliser une chromatographie d’exclusion stérique. Cette étape a permis de sélectionner spécifiquement la forme monomérique de notre enzyme, et de se débarrasser des éventuels agrégats qui auraient pu se former dans l’échantillon. En effet, nous souhaitions obtenir un échantillon le plus homogène et monodisperse possible afin de maximiser nos chances de cristallogenèse. La chromatographie d’exclusion stérique a été réalisée sur une colonne Séphacryl S-100 HR qui dispose d’un domaine d’exclusion allant de 1 à 100 kDa. Notre protéine Bmt3 a une masse moléculaire d’environ 60 kDa. Les monomères de Bmt3 se retrouvent donc dans la gamme de masse moléculaire de la colonne, mais si des dimères (ou des agrégats plus importants) se forment, ils sont élués dans le volume mort de la colonne (Figure 44).

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Le signal observé pour la population monomérique de Bmt3, bien que relativement fin, s’étale tout de même sur plusieurs fractions d’élution de 1 mL chacune (de B15 à B8, soit 8 mL en tout). L’échantillon qui était somme toute bien concentré après l’étape de purification se retrouve dilué après l’étape de chromatographie d’exclusion. Une mesure de l’absorbance à 280 nm permet de calculer une valeur de concentration, grâce au coefficient d’extinction massique théorique déterminé pour Bmt3 (ε = 1.586). Nous obtenons une concentration d’environ 1 mg/mL, ce qui est nettement plus encourageant que ce que nous obtenions lors de nos tentatives de purification avec l’enzyme recombinante produite chez P. pastoris. Il convient désormais de concentrer ces 8 mL à 1 mg/mL jusqu’à atteindre une concentration d’environ 15 à 20 mg/mL. Nous utilisons pour cela la technique de concentration sur Vivaspin 20 décrite précédemment.

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Figure 44 : Séparation des populations monomérique et multimérique de Bmt3 en solution par chromatographie d'exclusion stérique sur colonne Séphacryl S-100 HR. Suivi par mesure de l’absorbance à 280 nm (bleu) et de la conductimétrie (marron).

Nous avons donc établi un processus de préparation d’échantillon purifié, homogène, monodisperse et stable. En répétant toutes ces opérations à plusieurs reprises, nous disposons ainsi de suffisamment de matériel pour envisager des essais de cristallogenèse.

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