3.1.1 Alignement multiple des séquences de la famille GT91
Nous avons tout d’abord cherché à mettre en évidence des résidus conservés au sein de la famille GT91. Nous recherchions ici à identifier des résidus qui pourraient être impliqués dans le mécanisme catalytique des CaBmt. Nous avons expliqué dans un chapitre précédent que pour des glycosyltransférases possédant un mécanisme par inversion de configuration, comme c’est le cas pour les CaBmt (formation d’une liaison β-1,2 à partir d’un substrat donneur, le GDP-mannose, lié en α), la chaîne latérale d’un résidu présent au niveau du site actif allait permettre de déprotoner l’accepteur nucléophile. Classiquement, la fonction carboxylate des résidus glutamate et aspartate est décrite pour remplir ce rôle dans des mécanismes par inversion de type SN2.
Grâce au logiciel MAFFT, nous avons ainsi procédé à l’alignement multiple des séquences protéiques des membres de la famille GT91 qui étaient décrits dans la base de données UniProt (33 au moment où l’alignement a été effectué, 38 à l’écriture de ce manuscrit), dont les CaBmt (Figure 48). Nous identifions clairement des blocs de résidus plus ou moins conservés à travers ces 33 séquences. Cette figure 48 reprend à titre d’exemple l’alignement multiple, sur une petite centaine de résidus, correspondant aux résidus 231 à 288 pour CaBmt3, au sein desquels 3 blocs de conservation peuvent être identifiés. Parmi eux, nous recherchons des résidus d’acide glutamique (E) ou d’acide aspartique (D) conservés dans ces 33 séquences (Figure 48, rectangles pointillés noirs). De cette façon, nous avons identifié au total sept résidus (trois acides glutamiques et quatre acides aspartiques) susceptibles de jouer le rôle de nucléophile-base dans le mécanisme catalytique des CaBmt.
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Figure 48 : Alignement des séquences protéiques des membres de la famille GT91 grâce au logiciel MAFFT. Les CaBmt sont indiquées à gauche. Au sein de blocs de résidus conservés (rectangles orange), il est possible d’identifier des résidus d’acide aspartique et d’acide glutamique conservés dans toute la famille GT91 qui pourraient être des résidus catalytiques (rectangles pointillés noirs). Parmi les séquences des enzymes d’initiation CaBmt1/2/5/9 (rectangle bleu), il est possible d’identifier des résidus conservés différents du reste des membres de la famille GT91 (valine/isoleucine contre alanine/proline) qui pourraient être responsables de la spécificité de substrat de ces enzymes d’initiation (rectangle continu noir).
Avec la même approche, nous avons recherché d’autres résidus qui pourraient être impliqués, de manière indirecte, dans le mécanisme catalytique. En particulier, il est possible de différencier au sein des CaBmt les enzymes responsables de l’initiation du motif β-Man, les CaBmt1, 2 et 5 (voire CaBmt9 en se basant sur la proximité phylogénétique de cette dernière envers les trois autres (Mille et al. 2012) (Figure 49)), des enzymes responsables de l’élongation de ce motif, les CaBmt3, 4 et 6 (Figure 48, rectangle bleu). En effet, si l’on regarde la spécificité de substrat de ces deux sous-familles, nous pouvons dire que les enzymes d’initiation ont besoin d’un substrat accepteur lié en α-1,2, tandis que les enzymes d’élongation vont nécessiter un substrat dont l’extrémité non réductrice est en β-1,2. Cette différence de spécificité de substrat accepteur pourrait être due à des résidus qui seraient conservés uniquement dans la séquence des enzymes d’initiation. Nous avons donc regardé, sur
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cet alignement, si des résidus étaient conservés chez les CaBmt1/2/5/9, mais pas au niveau des autres séquences où l’on retrouverait des résidus conservés mais différents (Figure 48, rectangle continu noir). Six résidus présents dans la séquence des enzymes d’initiation sont susceptibles d’être impliqués dans leur spécificité de substrat accepteur α-1,2.
Figure 49 : Alignement des séquences nucléiques des neuf CaBMT grâce au logiciel d’alignement multiple AlignX. L'arbre phylogénétique a été obtenu par la méthode neighbour joining. Les enzymes dites d’initiation CaBmt1, CaBmt2 et CaBmt5 (ainsi que CaBmt9) s’alignent ensemble. De la même manière, les enzymes dites d’élongation CaBmt4 et CaBmt6 s’alignent ensemble.
En utilisant le même type de raisonnement, il est également possible de déterminer la présence de résidus propres aux enzymes d’élongation ayant une activité polymérase. En effet, parmi les enzymes d’élongation, nous avons vu que CaBmt3 n’était capable, in vitro, d’ajouter qu’un seul résidu β-1,2-mannosyl supplémentaire. Or, que ce soit sur PPM ou sur le PLM, les motifs β-Man peuvent compter plus de deux résidus β-1,2-mannosyl. Les enzymes CaBmt4 et CaBmt6 devraient être théoriquement capables, sur base des études par génétique inverse (Mille et al. 2008, 2012), d’allonger ces motifs, et donc posséder une activité polymérase. Nous avons donc cherché, au sein de leurs séquences, des résidus spécifiques conservés. Quatre résidus ont ainsi été identifiés.
Au final, sur la base de l’analyse de l’alignement multiple des séquences, nous avons identifié 17 résidus potentiellement impliqués dans le mécanisme catalytique et/ou la spécificité de substrat. Le rôle de ces résidus sera analysé par mutagénèse dirigée. Afin d’affiner notre analyse et de fait restreindre le nombre de résidus à analyser, nous avons cherché à prédire la position de ces résidus sur l’enzyme par des modélisations moléculaires.
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3.1.2 Modélisation 3D de CaBmt3
Nous avons utilisé le logiciel I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) pour obtenir un modèle tridimensionnel de CaBmt3 (Zhang 2008; Roy et al. 2010; Yang et al. 2015). Après soumission de notre séquence protéique primaire, ce service identifie des modèles structuraux à partir de la base de données PDB grâce à une approche de prédiction de structure en parallèle sur de multiples fragments de séquence. Plusieurs modèles atomiques reprenant la séquence complète sont ensuite construits par assemblage itératif de tous les modèles fragmentaires déterminés à l’étape précédente. Enfin, des renseignements sur la fonction potentielle de la séquence soumise sont déterminés par confrontation des modèles 3D utilisés à la base de données des fonctions protéiques BioLiP (focalisée sur les interactions ligand- protéine).
Le modèle le plus probable de CaBmt3 proposé par I-TASSER (Figure 50) est composé de deux domaines globulaires. Le domaine C-terminal, qui contient tous les résidus catalytiques potentiels prédits, adopte une structure bien décrite dans la littérature, le β-propeller (Chen et al. 2011).
Figure 50 : Modélisation 3D de CaBmt3 en mode cartoon (gris) grâce au logiciel I-TASSER. Six cibles potentielles de mutagénèse dirigée, parmi les dix-sept identifiées, sont représentées à titre d’exemple. Deux résidus catalytiques nucléophile-base (rouge), deux résidus impliqués dans la spécificité de substrat α/β (bleu) et deux résidus impliqués dans l’activité polymérasique (vert). L’organisation 3D du domaine catalytique (à droite) semble correspondre à un β-propeller à cinq pales (flèches noires).
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Cette structure, très symétrique, est composée de quatre à dix répétitions de quatre brins β anti-parallèles. Selon le nombre de répétitions, (composant les pales de l’hélice), la fonction de la protéine va varier. On retrouve par exemple des domaines de liaison à un ligand (quatre, cinq, six ou sept pales), une activité hydrolase (cinq, six ou sept pales) ou encore une fonction de signalisation (six, sept ou dix pales). Des anomalies au niveau de protéines porteuses de ces β-propellers ont néanmoins été associées à diverses pathologies chez l’Homme. Concernant CaBmt3, il semblerait qu’elle présente un β-propeller à cinq pales. Or, parmi les fonctions retrouvées, l’activité transférase n’est décrite qu’avec un β-propeller à cinq pales, comme c’est le cas pour la glutaminyl cyclase de Xanthomonas campestris par exemple (Huang et al. 2010). De plus, si l’on répète cette modélisation I-TASSER pour les autres CaBmt, on retrouve dans la grande majorité des cas cette organisation en β-propeller à cinq pales (pour les CaBmt1 à 7, mais pas pour CaBmt8 et CaBmt9). Ces éléments nous confortent donc dans le bien-fondé et la robustesse de cette modélisation 3D.
Figure 51 : Modélisation 3D du domaine catalytique de CaBmt3 grâce au logiciel I-TASSER. Au centre, identifiant potentiellement le site actif, sont représentés le substrat β-mannose (cyan) et l’ion divalent Mg2+ (orange). Parmi
les dix-sept cibles de mutagénèse dirigée mises en évidence - résidus catalytiques nucléophile-base (rouge), résidus impliqués dans la spécificité α/β (bleu) et dans l’activité polymérase (vert) - seuls celles les plus proches du site actif seront choisies pour être mutées.
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A partir de ce modèle, nous avons ainsi pu visualiser la position des dix-sept cibles de mutagénèse dirigée, et déterminer leurs positions respectives vis-à-vis du site actif prédit. Nous avons également réalisé la modélisation 3D par I-TASSER de la séquence C-terminale recouvrant le domaine catalytique (Figure 51). De façon certes moins nette, nous y retrouvons également une organisation en β-propeller, avec au centre, un substrat (du β-mannose) et un ion métallique divalent (le Mg2+). Là encore,
nous y plaçons les cibles de mutagénèse. Pour avoir un rôle clé dans le mécanisme catalytique, les résidus impliqués doivent être suffisamment proches du substrat au niveau du site actif, d’autant plus s’il s’agit des résidus supposés catalytiques. Nous avons donc choisi de privilégier l’étude des résidus les plus proches du site actif, écartant par là-même les résidus prédits comme étant les plus éloignés. Ainsi, au final, nous avons retenu :
• cinq résidus catalytiques nucléophile-base : E258, D259, E277, D473 et D483
• six résidus impliqués dans la spécificité α/β : K176, C178, A257, H403, E481 et K487
• deux résidus impliqués dans l’activité polymérase : T208, L495.