Les réseaux de gènes

L’analyse des gènes diffé rentiellement expr imés entre les conditions « contrôle » e t « activée LPS-IFNγ » a été conduite avec deux approches com plémentaires. La prem ière approche utilisée, la méthode GSEA (Subramanian et al., 2005), est gl obale et permet d’analyser un ensem ble de gènes. En e ffet, cette méthode de calcul déterm ine si a priori un ensemble déf ini de gènes m ontre des différences c oncordantes statistiquement significativ es entre deux ét ats biologiques. Cette approche nous permet de mettre l'accent sur des ensembles de gènes (o u réseaux) a vant de se concentrer s ur les gènes présentant des différent iels d’expression élevés. L es gènes sont cl assés dans un e liste selon leur différentiel d’ expression entre les deux états, puis un score d'enrichisse ment est calculé co mme décri t dans la partie « Matériels et Méthodes ». Cette analyse peut être menée en couplant les données avec les voies canoniques bien connues, les catégories ontologi ques et pour certaines esp èces, la position des gènes sur les chrom osomes. En utilisant cette approche, 20 ensembles de gènes ont été trou vés positivement régulés (Annexe 3), dont une voie r égulée par TNF α et sept par différents interférons. Les groupes de gènes im pliqués dans la maturation des cellules dendritiques ainsi que ceux impliqués lors de l'infection des fibroblastes sont aussi positivement enrichis. De plus, 18 ensembles de gènes sont négativement régulés (Annexe 3). Dans ceux-ci, 2 sont impliqués dans la stru cture du cy tosquelette et 2 autr es so nt liés aux protéines ribosom iques. Les ensembles définis avec ce modèle de macrophage porcin ne correspondent pas complètement à ceux présents dans les bases de données hu maines ou m urines. Les correspondances entr e espèces conduisent à la reconnaissance d’ environ la m oitié des gènes présents dans les ensembles définis. Cette approche no us a néanmoins permis d'obtenir une première vue globale des gènes impliqués lors de l'activation LPS-IFNγ.

Figure 40 : Réseaux de gènes induits liés à l’activation LPS-IFNγ identifiés par IPA.

a: réseau 1, b: réseau 2, c: réseau 3. Les gènes sur-exprimés sont présentés en rouge et les sous-exprimés en vert. L'intensité de la couleur est directement proportionnelle aux valeurs du changement observé signalé dans le tableau annexe 2. Les c omposants de chaque ré seau i dentifiés pa r l' algorithme mais non détectés dans notre anal yse sont présentés en blanc.

Résultats

Romain solinhac 65

Thèse en génétique / 2011

Institut national de la recherche agronomique Toulouse

Pour com pléter cett e anal yse, une autre approche : « Ingenuity Pathway Analysis »

(IPA) a également été réalisée. Cette approche a permis de recueillir des informations sur les 60

gènes différentiellement exprimés ainsi que sur leurs interactions potentielles. Trois réseaux de gènes ont été construits à partir de cette liste. Les gènes soumis à l’analyse ont été catégorisés en différentes fonctions biol ogiques relativem ent à celles présentes dans le catal ogue Ingenui ty. Les trois fonctions les plus représentatives sont :

- « Diseases and Disorders »

- « Molecular and Cellular fonctions »

- « Physiological System Development and Function »

Plus précisément, dans chaque fonctio n, cinq grandes catégories ont été définies et sont présentées dans la Figure 39. Parmi celles-ci, la catégorie « Genetic Disorder » (24 gènes) e st bien représentée, probablement en r aison du nom bre important d'éléments de régulation et de facteurs lié s à l’ induction des 60 gènes séle ctionnés. Les autres grandes caté gories « antigen presentation » (22 gènes), « haematological sy stem development and function » (23 gènes) e t « cell mediated immune response » ( 21 gènes) sont claire ment liées au modèle cellulaire. Globalement, parm i les 1 5 catégories trouvées pa r l’analyse IPA, la m oitié (8) sont lié es à l'immunité.

L’approche Ingenuit y a égalem ent permis la construction de rés eaux de gènes. Trois réseaux présentant des sco res supérieurs à 5 (c' est-à-dire présentant une probabilité de 0,99 d e ne pas être générée par hasard) ont été construits (Figure 40).

Le réseau 1 avec le plus haut score (49) implique 20 gènes sur-exprimés (Figure 40a). Il est associ é au m ouvement cellulai re, au développem ent et à la foncti on du s ystème hématologique, au mouvement des cellules immunitaires. Un nombre important de cytokines et de chimiokines telles que les interférons est lié à ce réseau. La p rotéine MAP kinase p38 est fortement impliquée dans ce réseau notamment par ces multiples interactions.

Le réseau 2 présente un score de 25 et regroupe 12 gènes, 11 étant sur-exprimés et un sous-exprimé lors de l’activation du macrophage (Figure 40b). Impliqué dans le développement et la fonction du tissu conj onctif, la morphologie des tissus et le cancer, ce réseau est constitué autour de l'interféron gamma et du proto-oncogène MYC.

Le réseau 3, avec le score le plus bas (1 9) regroupe 11 gènes, dont 8 sont sur-ex primés et 3 sous-exprimés (Figure 40c). Relatif à la mobilité cellulaire, le développement et la fonction du s ystème hé matologique et le trafic des cellu les i mmunitaires, ce rése au es t centré sur les cytokines IL1β et IL8, et comprend des complexes NFKBIA et de NFkB.

Ces résultats montrent que les gènes d ominants tou chés par la stim ulation LPS-IFN γ sont ceux liés à l' immunité, le mouvement cellu laire et les interactions cellulaires, co mme attendu lors de la mise en place et le déroul ement de la réponse immunitaire. En out re, l'approche GSEA a souligné l'implication du cytosquelette et des protéines ribosomiques dans le processus d'activation.

Tableau 10 : Liste des gènes sélectionnés pour l’analyse de l’organisation nucléaire

Symbole

du gène Fonction cellulaire

Identifiant du BAC Position chromosomique Séquence mRNA Séquence génomique

NEDD4L enzyme (down regulation of the intracellular Na+ concentration)

VIM type III intermediate filament _{(cytoskeleton)} PigI0175A12 10q15-q17 DQ190948 AY368193

LGALS3 cytokine (chemo-attractant for monocytes, macrophages, and neutrophils) PigI0780A07 1q2.3-q2.4 NM_001142842 na

TUBA3 microtubules component _{(cytoskeleton)} PigI1096G01 5p1.2 NM_001044544 DQ084490

IL1β

cytokine (inflammatory response, cell proliferation,

differentiation, and apoptosis)

PigI0492C09 3q11-q14 NM_214055 X74568

SLAMF7 membrane protein (NK cell _activation) IL8 response, chemo-attractant cytokine (inflammatory

for neutrophils)

PigI0957B06 8q1.2 NM_213867 AB057440

CXCL10 attractant for stimulated Th1 chemokine (chemo- cells and monocytes)

PigI0150G01 8q1.2 NM_001008691 AY894692

IGF2 hormone (development and _growth) PigI0370D12 2p1.7 NM_213883 AY044828

TNFα

cytokine (inflammatory response, produced by

macrophages) PigI0493A06 7p1.1 NM_214022 AJ251914

Résultats

Romain solinhac 66

Thèse en génétique / 2011

Institut national de la recherche agronomique Toulouse

2.5. Choix des gènes différentiellement exprimés pour l’analyse de