Position relative aux territoires chromosomiques

Nous nous sommes également intéressés à la position des gènes par rapport à leu rs territoires chromosomiques respectifs. Nous avons utilisé la sonde du gène (BAC) combinée à la sonde du territoire chromosomique dans des expérien ces de FISH 3D (Figure 43). Nous avons obtenu pour chaque paire "gène / territoire chrom osomique", la distance 3D entre le centre du gène et le bo rd du territoir e chromosomique et le pourcentage de co-localisation du gène dans son territoire chromosomique. Les résultats sont présentés dans la figure 45.

La prem ière observation i mportante est que la positi on des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques est différente d'un gène à un autre. VIM se positionne clairement en dehors de so n territoire c hromosomique (Figure 45a) dans 75% des cellules au repos et 74% des cellules activées. De la même façon, plus de 60% des signaux IGF2 sont situés en dehors du territoire SSC2 dans les deux co nditions ( Figure 45e ). Inve rsement IL1 β et ZAR1 sont clairement situés dans leurs territoires chromosomiques (les signaux fluorescents étant dans leur territoire respectif dans plus de 50% de s cellules analysées quelque soit l 'état) (Figure 45g, i ). D'autres gènes s e loc alisent préfér entiellement au bord ou à l 'extérieur des t erritoires chromosomique dans les deux conditions: c'est le cas de LGALS3 (Figure 45b), TNFα (Figure

45f), IL8 ( Figure 45h) et CXCL10 ( Figure 45c). Enfin, aucune tendance ne se dessine pour

TUBA3 (Figure 45d) qui est également réparti dan s les trois classes (environ 30% à 35% des signaux dans toutes les classes).

Le deuxième point important est que parmi ces 9 gèn es, le test χ2 _{utilisé pour comparer}

les classes d e position ré vèle une diff érence entre les deux états pour un seul gène. Il s' agit d'IL8, sur-exprimé dans l’état actif, qui se dé place clairement en dehors du territoire SSC8 (p = 0,003) lors d e l'activation: le nom bre d'événements dans la catégo rie « intérieur » diminue (de 22% à 11%) tandis qu'il augmente dans la catégorie « extérieur » (de 40 % à 50%). Cependant, même si le n ombre d'évènements dans les trois catégories ne varie pas significativement pour TNFα et CXCL10, n ous avons observ é que les gènes ont tenda nce à être en dehors de le urs territoires chromosomiques.

Figure 45 : Positionnement nucléaire des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques dans les noyaux de macrophages et de neutrophiles porcins.

Le nombre de couples gène/TC (n) analysés dans chaque condition est indiqué en haut à gauc he de l 'histogramme. La di stribution d' un gène donné a ét é t riée en 3 cl asses (intérieur, bord, extérieur) et comparée entre les cellu les contrôles (en gris) et cellu les activées LPS/IFN γ (vert, p our l es gè nes s ous e xprimés ; ro uge pour l es gènes s ur exprimés, ou noi r p our l e gène non ex primé). Les di fférences st atistiques o nt ét é évaluées par un test de χ2. Les valeurs de p-values sont indiquées sur les graphiques (en haut à droite).

Tableau 11 : Analyses des distances externes entre les bords des TC et les centres des gènes

Macrophages Contrôles Macrophages Activés

Symbole du gène distance moyenne bord du TC/centre du gène (µm) rayon moyen du noyau (µm) moyenne des distances normalisées (a) distance moyenne bord du TC/centre du gène (µm) rayon moyen du noyau (µm) moyenne des distances normalisées (a) P-values LGALS3 0,2518 2,6011 0,0967 0,2267 2,6354 0,0866 0,2468 VIM 0,5489 2,6297 0,2095 0,621 2,6124 0,2356 0,1313 TUBA3 0,2976 2,6107 0,115 0,335 2,5974 0,1282 0,5312 IGF2 0,6219 2,6326 0,2367 0,7912 2,6432 0,2949 0,4763 TNFα 0,3466 2,5799 0,1329 0,5403 2,5301 0,2155 0,001 (**) IL1β 0,2649 2,5834 0,1038 0,2897 2,6262 0,1101 0,2861 IL8 0,2366 2,624 0,0901 0,339 2,564 0,1332 0,0226 (*) CXCL10 0,2735 2,6284 0,1047 0,4544 2,616 0,1737 0,0251 (*) ZAR1 0,31 2,7419 0,1185 0,3162 2,7085 0,1175 0,2778

Pour chaque cellule, les distances bord du TC-centre du gène ont été normalisées par le rayon nucléaire correspondant, pour tenir compte des variations dans la taille du noyau. Les valeurs moyennes de ce s distances norma lisées sont présentées dans le tableau 2 (a). La comparaison des di stributions de ces distances no rmalisées entre les de ux conditions a été réalisée avec un test de Mann -Whitney Wilcoxon. Les P-v alues inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.

Figure 46: Comparaison de l'expression des ARNm des cytokines (TNFa, IL1β, IL8, CXCL10) dans plusieurs types cellulaires.

La valeur de l'expression de chaque cytokine a été normalisée par l'expression du gène de ménage (B2μ) dans le même type cellulaire. Les fibroblastes ont été choisis comme référence pour la variation du niveau d’expression. La d ifférence d e n iveau d’expression pour chaque type de cellule est indiquée au dessus de chaque barre.

Résultats

Romain solinhac 69

Thèse en génétique / 2011

Institut national de la recherche agronomique Toulouse

Pour approfondir ce poi nt, nous avons comparé les distances « centre des gènes / bord de leur TC » pour la catégorie « extérieur » en tre les deux états « contrôle et activé ». Pour réaliser une com paraison objective tenant com pte des variations dans la taille des noyaux, ces distances ont été normalisées par le rayon de chaque noyau (Tableau 11). Les résultats d'un test de Mann-Whitne y Wilcoxon a révélé que ces di stances extér ieures aug mentent dans les macrophages activés pour TNFα (p=0,001), IL8 (p=0,022) et CXCL10 (p=0,032). Au contraire, aucune variation signif icative n'a été détectée pour IL1 β (p=0,20) et pour les 4 gènes régul és négativement (TUBA3 p=0,61 ; LGALS3 p=0,29; VIM p=0,31; IGF2 p=0,45).

Pour déterm iner si ces résultats sont sp écifiques d e ce ty pe cellulaire, nous avons analysé le com portement de certains g ènes par rapport à leurs ter ritoires chromosomiques lors de l’activation par du LP S dans un autre ty pe de cellules de la famille des phagoc ytes : les neutrophiles. Même si les macrophages et les neutrophiles appa rtiennent au même ty pe de cellules i mmunitaires, leurs mécanismes d'action contre l' infection bactérienne sont très différents. En outre, une différence i mportante entre ces ty pes cellulaires ex iste puisque les neutrophiles présentent un noyau polylobé (Figure 43).

L'analyse co nduite sur les neutrophiles porte sur 3 gènes régulés positivem ent TNF α, IL1β et IL8, deux régulés négativement TUBA3 et IGF2 et sur l e gène non exprim é ZAR1. Nous avons d’ abord confi rmé par qRT -PCRs que ces gènes ont le même statut d’ expression dans les neutrophiles et les macrophages (Figure 41b).Les analyses FISH 3D effectuées sur les neutrophiles contrôles et activés ont révélé que, globalement, les positions des gènes par rapport à leurs territoires chrom osomiques sont sim ilaires d ans les deux types cellulaires: TUBA3 se répartit sur les trois positions, TNF α, IL8 et IGF2 ont tendanc e à être en dehors de leurs territoires ch romosomiques, tandis qu’ IL1β reste de préférenc e dans son territoire. Fait intéressant, seulement IL8 montre un repositionnement clair en dehors de son TC à l a fois dans les macrophages (p = 0,003) et les neutrophiles (p = 10-16_{) activés (Figure 45).}

Enfin, pour déterminer si la position préfér entielle au bord ou à l' extérieur du territoire chromosomique des cy tokines sur-exprimées est spécifique des cellule s e ngagées dans la réponse immunitaire nous avons également analysé le comportement de ces gènes (TNFα, IL1β, IL8 et CXCL10) dans des fibroblastes utilisés co mme lignée de cellules contrôles non liée à la réponse immunitaire. Nous avons d' abord analysé l'expression de ces cytokines par qRT-PCR (Figure 46). Cette analyse a révélé que les 4 cytokines sont nettement plus ex primées dans les cellules i mmunitaires que dans les fibroblastes: IL8 est 47 0 fois plus ex primé dans les macrophages activés que dans les fi broblastes, CXCL10, 287 8 fois, TNF α, 47 fois et en fin IL1β, 764 fois (Figure 46). Des analyses FISH 3D ont ensuite été effectuées sur des fibroblastes (Figure 43 ) et ont révélé que, bien qu’IL 8 et CXCL 10 aient tendance à êtr e clair ement à l a bordure ou en dehors de leurs territ oires chro mosomiques da ns les cellul es i mmunitaires quelque soit l eur état (activé ou contrôl e), ils n'ont pas la même position dans l es fibroblastes, où ils sont é galement rép artis dans le s trois clas ses ( Figure 47c, d ). Par contre, TNF α se

Figure 47 : Positionnement des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques dans les noyaux de fibroblastes (bleu) par rapport aux cellules immunitaires quiescentes (gris pour les macrophages et gris hachuré pour les neutrophiles) et act ivées (r ouge pour l es macrophages et rou ge hachuré p our l es neutrophiles). Le nombre d e loci (n ) an alysé pou r c haque gène et dans c haque condition est i ndiqué en h aut à g auche d e l'h istogramme. La distribution d 'un gène donné a été classée en 3 catégories (i ntérieur, bord, extérieur). Les différences statistiques ont été évaluées par un test de χ2 et l es p-v alues so nt i ndiquées sur l es graphiques (en haut à droite).

Résultats

Romain solinhac 70

Thèse en génétique / 2011

Institut national de la recherche agronomique Toulouse

positionne en bordure ou en dehors de son TC dans les trois types cellulaires. IL1 β qui s e positionne à l’intérieur de son TC dans les cellules immunitaires quelque soit l’état d’activation présente également ce positionnement préférentiel dans les fibroblastes (Figure 47b)

3.3. Comportement des territoires chromosomiques dans les