Choix des gènes différentiellement exprimés pour l’analyse de la position nucléaire

Pour répond re à la thématique posée, c'est -à-dire analy ser si une variation de l'expression des gènes (positive ou négative) s’accompagne d’un repositionnement dans l'espace nucléaire, pa rmi les gènes présentant une expr ession différentielle (analy se transcripto mique) Les 4 gènes les plus sous-exprimés lors de l’activation ont été sélectionnés :

- NEDD4L (N eural precurs or cell Expressed D evelopmentally D own-regulated 4 - Like),

- VIM (Vimentin),

- LGALS3 (lectin galactoside-binding soluble 3), - TUBA3 (Tubulin α 3),

ainsi que les 4 gènes les plus sur-exprimés : - IL1β (Interleukin 1 β),

- SLAMF7 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family member 7), - IL8 (Interleukin 8),

- CXCL10 (C-X-C motif Ligand 10).

Un autre candidat a été ajouté à la liste des gènes sur-exprimés : TNFα de par son rôle important dans la régulation de l’inflammation (Bradley, 2008). Curieusement, ce gène n’est pas sorti de l’analy se du transcriptome, mais est néanmoins trouvé d ifférentiellement exprimé par PCR quantitative. Les sondes ciblant ce gène sur la puce ne sont pas bien définies (Rogel - Gaillard co mmunication personnelle), ce qui expliquerait son absence dans les gènes différentiellement exprimés.

Pour avoir une analy se complète, un gène qui ne présente pas de variation significative entre les états d’activatio n du m acrophage (contrô le et actif) a été ajouté à la liste : IGF2 (Insulin Growth Factor 2), me mbre d e la fa mille des facteurs de croissance polypeptidiques. Enfin un gène non exprimé a également été ajouté à l’analyse afin d’avoir un « gène témoin » : ZAR1 (Zy gote Arrest 1). Celui-ci est un gène spécifique de l’o vocyte qui participe à la transition de l’œuf à l'embryon. Les gènes sont listés dans le Tableau 10.

Avant d'étudier leur local isation nucléaire , les expressions diff érentielles de s gène s choisis ont ét é validées pa r PCR quanti tative en te mps réel (qRT -PCR). Le gène de ménage bêta-2-microglobuline a été inclu comme référence pour la normal isation des données. Afin de renforcer la comparaison entre les deux technologies, les PCR qua ntitatives ont été réalisées en utilisant les mêmes échantillons d'ARN que ceux utilisés pour les expériences d e puces à ADN. Les variations de ratios o nt été cal culées dans l es deux cas. Le s résultats so nt globalem ent concordants entre les deux approches mais le s variations d’ expression prése ntent une plus grande am plitude dans les expériences de qRT-PCR par rapport à l'approche puce à ADN (Figure 41a). Des différen ces ont été observées pour deux gènes. En effet, bie n que NEDD4L ait été déterminé comme étant sous-exprimé par l'analyse puce à ADN, l’analyse qRT-PCR n'a

Figure 41 : Graphiques normalisés pour les niveaux d'expression d'ARNm dans les macrophages et les neutrophiles.

a) Co mparaison d es m éthodes p uce à ADN et PCR q uantitative p our l’an alyse d es niveaux d'expression d'ARNm dans l es macrophages quiescents et activés. b) Niveau d'expression d es AR Nm dans l es neut rophiles act ivés par rap port au x neut rophiles contrôles a nalysés par qR T-PCR. Pour c haque gène, l e ni veau d' expression dans l es cellules n on s timulées est pri s com me référence . ( * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001).

Résultats

Romain solinhac 67

Thèse en génétique / 2011

Institut national de la recherche agronomique Toulouse

pas confir mé ce ty pe de régulation. A l’ opposé, IGF2 qui ne présente pa s d’ expression différentielle par les expériences de puce est tro uvé sous-exprim é par qRT-PCR. La PCR quantitative étant une méthode plus pr écise, nous avons élim iné NEDD4L et conservé IGF2 pour l' analyse de la posit ion nucléaire par FISH 3D. La non-expression de ZAR1 dans les macrophages a été vérifiée par RT-PCR classique (Annexe 4).

3. Analyse de la position nucléaire des gènes différentiellement

exprimés par FISH 3D.

Pour déterminer si l’or ganisation nucléaire est modifiée dans les macrophages lors de l’activation, l’étape suivante a consisté à étudier la localisation nucléaire des gèn es sélectionnés et de leurs chromosomes associés par FISH 3D. L a co mbinaison m icroscopie confocale et analyse d'images 3D permet d’étudier le positionne ment nucléaire des gènes choisis par rapport au ray on nucléaire mais aussi par rap port à leurs territoires ch romosomiques. Nous avo ns comparé les données issues des deux états (quiescent et activé).

La première étape a consisté à i soler d es B ACs contenant les gè nes sél ectionnés et à vérifier leur l ocalisation par hy bridation in situ sur chrom osomes métaphasiques (Figure 42). Nous avons également vérifié la qualité des s ondes de peinture chrom osomique. Les sond es présentant une localisatio n différente de celle attendue ont été éli minées. Ainsi, SLAMF7, initialement sélectionné, a été rejeté de la liste, car la sonde utilisée ne cible pas le chromosome attendu (SSC 4). Les gène s sélectionnés se positionn ent sur différents chromosomes (SSC1, SSC2, SSC3, SSC5, SSC7, SSC8 et SS C10). Fait intéressant, trois gènes sur les 9 étudiés sont présents sur le même chromosome (SSC8) et présentent des statuts d'expression différents, deux étant sur-exprimés (IL8 et CXCL10) et un non exprimé (ZAR1).

Nous avons ensuite utilisé les clones BACs dans des expérien ces FISH 3D sur des noyaux de macrophages dont la structure a été conservée (Figure 43). Pour chaque couple gène/ territoire chromosomique, des coupes optiques de 120 à 160 noyaux ont été générées, et ce, pour chaque état (repos et activé). Quatre-vingt-tro is pour cent des noy aux ont été sélectionnés et analysés. Les piles d 'images ont été analy sées a vec le logic iels NEM O qui permet la segmentation des objets dans les noy aux mais ég alement de réa liser des mesures de distance entre ces objets comme décrit dans « Matériels et Méthodes ».