Le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) utilise le complexe LIFR\Gpl30 couplé avec son récepteur spécifique (CNTF-a) pour induire une signalisation cellulaire. CNTF est majoritairement exprimé dans les cellules gliales du système nerveux central et périphérique. Cette cytokine est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes, dans la promotion de la survie et de la differentiation de nombreux types de cellules neuronales. CNTF est aussi exprimé dans des cellules non neuronales, telles les cellules musculaires squelettiques, les cellules embryonnaires et chez les cellules de la matrice osseuse [132].
L'oncostatin M (OSM) fait partie de la famille des cytokines de IL-6 et partage une très grande similarité structurale avec LIF. Cette cytokine peut induire une réponse cellulaire via deux complexes de récepteurs, avec son récepteur spécifique (OSMR) et Gpl30 ou avec LIFR et Gpl30. Tout d'abord reconnu pour avoir un effet dans la prolifération de cellules tumorales, de récentes études indiquent que OSM pourrait avoir une activité biologique dans le processus d'inflammation, dans l'hématopoïèse ainsi que dans le développement et la formation de tissus osseux. La présence de l'ARN messager de OSM a été abondamment détectée dans des tissus hématopoïétiques, tels la matrice osseuse, le thymus et la rate [133].
La cardiotrophine I (CT-1) fait aussi partie de la famille des cytokines IL-6 et utilise le complexe LIFR/Gpl30 couplé à son récepteur spécifique (CT-R) pour induire un signal cellulaire. La présence de CT-1 a été détectée dans les tissus du coeur, des muscles squelettiques, des ovaires, du foie et des poumons [134]. Aucune étude ne fait état de la présence de cette cytokine dans la matrice osseuse.
1.5.3 : Les évidences d'un rôle de LIFR dans la régulation du métabolisme osseux. 1.5.3.1 : LIFR est exprimé dans les ostéoblastes et les ostéoclastes.
Chez les muridés, LIFR a été détecté dans plusieurs lignées cellulaires ostéoblastiques à différents stades de differentiation, incluant les cellules problastiques de la voûte crânienne des rats [129], les cellules ostéoblastiques de MC3T3-E1 et les cellules MG- 63 de l'humain. Chez les cellules de la lignée MC3T3-E1, le nombre de récepteurs s'élève à environ 1000 [136] et LIF induit l'activation du signal de transduction de la cellule, impliquant la phosphorylation de Jak-1, de Jak-2, de gpl30 et de LIFR [137]. La présence de LIFR dans les ostéoclastes n'a pas été démontrée clairement, ce qui peut être attribuée à la difficulté d'obtenir une culture d'ostéoclastes pure. Bien que les
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cellules ostéoclastes multinucléées dérivées de rats nouveaux-nés n'ont pas permis la détection de LIFR [138], les cellules ostéoclastes-ressemblants dérivées de cellules tumorales humaines ont été identifiées comme exprimant LIFR et LIF [130].
1.5.3.2 : La famille des cytokines de type I est importante dans la régulation du métabolisme osseux.
Plusieurs cytokines de type I sont reconnues pour avoir une influence notable dans la régulation de la densité osseuse. Parmi les plus étudiées, on compte l'interleukine-6 (IL- 6) et 11 (IL-11) qui ne sont pas des ligands de LIFR, mais qui influencent la prolifération et la fonction des ostéoblastes et des ostéoclastes. Ces cytokines vont influencer la formation de tissus osseux et vont être impliquées dans certaines pathologies osseuses, telles l'ostéoporose et l'arthrite inflammatoire [139].
1.5.3.3 : LIFR médie la réponse cellulaire de LIF et OSM, deux cytokines importantes dans la régulation du métabolisme osseux.
LIF et OSM sont situés sur le chromosome 22ql2 [140], séparés par 500 kilobases et partagent plusieurs homologies de structure. OSM calque un nombre considérable d'activités biologiques de LIF à l'aide du même complexe de récepteurs (LIFR/Gpl30), ce qui explique en partie leur activité redondante. LIF est produit par des cellules stromales de la moelle osseuse et des lignées de cellules ostéoblastiques. De plus, l'expression de LIF est induite par des molécules clés dans la régulation du métabolisme osseux, telles la PTH (hormone parathyroïde) et la PTHrP (protéine reliée à l'hormone parathyroïde) [141].
Depuis le début des années 1990, plusieurs équipes de recherche se sont penchées sur l'effet de LIF et OSM sur la régulation et la formation de tissus osseux. Les premières études in vivo et in vivo ont indiqué que LIF favorisait l'ostéoclastogenèse et augmentait le taux de résorption osseuse de la voûte crânienne des souris [142] [143]. Ces observations corroboraient l'augmentation de l'ostéoclastogenèse observée chez les souris surexprimant LIF en grande quantité [144]. Plus récemment, ces résultats furent confirmés par une étude de l'effet d'un traitement de LIF et de OSM sur une culture de cellules de la matrice osseuse qui entraînait une augmentation de la résorption osseuse et une augmentation de l'expression de l'ostéoprotégerine et du récepteur de ligand de NF-K[3, deux molécules favorisant l'ostéoclastogenèse [145].
Dans un tout autre ordre d'idées, quelques équipes de recherche ont démontré que LIF avait un effet inverse sur le métabolisme osseux et augmentait l'ostéoblastogénése. Une
récente étude in vivo effectuée chez des souris traitées localement avec LIF a démontré que LIF allait augmenter significativement la densité osseuse des souris et se liait directement sur les ostéoblastes [146]. Il a aussi été démontré que LIF et OSM agissaient sur les ostéoblastes et favorisaient l'expression de la collagènase-3, une molécule impliquée dans l'inhibition de la résorption osseuse [147]. LIF et OSM semblent avoir un effet biphasique sur la formation de tissus osseux qui pourrait être expliqué par des conditions de culture variables et le stade de differentiation des cellules étudiées [148].
Aucune étude ne fait état de l'activité de CNTF et CT-1 sur la formation de la densité osseuse. Il a cependant été démontré que CNTF était exprimé constitutivement dans une culture d'ostéoblastes à différents stades de differentiation [129]
1.5.3.4 : Les souris déficientes en LIFR présentent des anomalies structurales et biologiques du squelette.
L'équipe de Ware [149] fut la première à observer les effets physiques et biologiques de la déficience en LIFR chez des souris (knock-out). L'absence de LIFR se caractérisait par la mort périnatale des souris et par des anomalies au niveau placentaire, neuronale et hépatique. Plus important encore, les souris déficientes en LIFR présentaient des anomalies très marquées du squelette, tant au niveau architectural que cellulaire. Les souris LIFR-/- étaient plus petites que les souris LIFR+/+ ou LIFR+/- et la densité osseuse du crâne, des vertèbres, des côtes et de l'extrémité des os longs était plus faible. Les études histomorpho métriques ont estimé que la densité osseuse des souris LIFR-V était 66% plus faible que celle des souris contrôles. De plus, le nombre d'ostéoclastes chez les souris LIFR-V était 6 fois plus important et la surface que les ostéoclastes occupaient était 7 fois plus grande. Les auteurs ont proposé que la perte de densité osseuse était le résultat du nombre accru d'ostéoclastes chez les souris LIFR-/- et que la présence de LIFR est probablement essentielle à une régulation efficace du métabolisme osseux. [149] Récemment, une équipe de recherche a observé chez des souris LIFR-/- [150] les mêmes effets au niveau architectural du squelette, ainsi qu'une augmentation du nombre de fractures.
1.5.3.5 : Les estrogènes augmentent le niveau d'expression de LIFR.
L'équipe de recherche de Lindbergh [151] a récemment tenté d'identifier in vivo chez la souris, des gènes dont l'expression dans les tissus osseux est modifiée suite à un
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traitement à l'estradiol. Ainsi, puisque les estrogènes jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme osseux, les gènes régulés dans la matrice osseuse par cette hormone pourraient être impliqués dans la régulation du métabolisme osseux. Lors de cette étude, LIFR s'est révélé être induit par l'estradiol après seulement 10 heures de traitement. L'expression de l'ARN messager de LIFR chez les souris traitées était 3,5 fois plus importante que chez les souris contrôles. De plus, le niveau d'expression de l'ARN messager de LIFR suite à un traitement à l'estradiol à long terme, s'est révélé être en corrélation avec la densité osseuse minérale trabéculaire des souris (r=0.82). Ainsi, les auteurs ont proposé que les estrogènes pourraient accroître la formation de densité osseuse en favorisant l'expression de l'ARN messager de LIFR [151].
1.5.3.6 : Des variants de LIFR sont impliqués dans le syndrome Stuve-Wiedmenn /Schwartz-Jampel (SWS) type 2.
En 2004, une équipe de recherche française a identifié chez 19 familles atteintes du syndrome Stûve-Wiedmenn, un total de 14 mutations rares présentes dans le gène de LIFR. La majorité de ces mutations provoquaient une terminaison précoce de la transcription et une absence totale de LIFR. Les auteurs croyaient que ces mutations non-sens étaient les uniques responsables du syndrome Stûve-Wiedmenn [152]. Les patients atteints du syndrome Stûve-Wiedmenn présentent plusieurs anomalies au niveau squelettique, telle une courbure anormale des os longs, une section corticale épaisse et une pauvre ossification du corps vertébral [153]. De plus, on note la présence d'un nombre accru d'ostéoclastes [154]. Ces observations sont comparables avec celles observées chez les souris LIFR-/-, ce qui laisse supposer que des altérations de LIFR chez l'humain pourraient entraîner des défauts architecturaux et causer une faible densité osseuse.
1.6 : Les polymorphismes et les principes généraux du génotypage.
1.6.1 : Les variations dans le génome et les « Single Nucleotide Polymorphisms» Il y plusieurs types de variations génétiques dans le génome humain, parmi ceux-ci on compte les polymorphismes de nucleotides simples ou « single nucleotide polymorphisms » (SNP), les séquences répétées (ex : VNTR, microsatellites), les insertions et les deletions. Ces variations peuvent s'étendre de une à plusieurs milliers de paires de bases. L'hypothèse la plus populaire est que ces variations seraient responsables des variations phénotypiques observées dans la population.
Un « single nucleotide polymorphism » est une variation d'un seul nucleotide dans la séquence d'ADN qui a une fréquence allèlique d'au moins 1 % dans la population. Les SNPs sont les variations les plus fréquentes dans le génome avec plus de 9 millions de variations répertoriées dans la base de données publique dbSNP du « National Center for Biotechnology Information» (NCBI) [155] [156]. Une étude récente a estimé qu'environ 200 000 SNPs seraient situés dans les exons et que 40 % de ces polymorphismes changeraient un acide aminé dans la séquence protéique [157]. Au cours des dernières années, les SNPs sont devenus des marqueurs de choix dans les différentes études génétiques et présentent plusieurs avantages sur les autres variations du génome. Tout d'abord, les SNPs sont présents en très grand nombre dans le génome humain et semblent être présents dans la majorité des populations. En effet, on estime que beaucoup de variations sont des variants communs chez les humains, c'est-à-dire que les SNPs pourront être retrouvés chez 90% des humains [158]. De plus, les SNPs sont beaucoup plus stables génétiquement que la majorité des variations (ex : microsatellite) et ont un faible taux de mutation [159]. Aussi, au cours des dernières années plusieurs technologies très fiables de génotypages de SNPs sont apparues et ont permis le génotypage des SNPs à grande échelle [160] [161].
1.6.1.1 : Les haplotypes.
Il est possible de tirer profit de l'organisation des SNPs et des autres variations génétiques dans le génome. En effet, les variations génétiques qui sont près l'une de l'autre auront tendance à être héritées ensemble. Par exemple, tous les individus ayant un T plutôt qu'un C à un endroit donné d'un chromosome peuvent présenter également d'autres SNPs dans la région voisine du T sur le chromosome. Ces régions de variations groupées sont connues sous le nom d'haplotypes. Les haplotypes du génome humain tirent leur origine des mécanismes moléculaires de la reproduction sexuée et de l'histoire de notre espèce [106]. Un retrouve un nombre limité d'haplotypes majeurs différents dans le génome humain. Ainsi quelques haplotypes peuvent représenter jusqu'à 90 % de la variance haplotypique dans une région chromosomique [162]. Donc
au lieu d'étudier les polymorphismes individuellement, il est possible d'utiliser les blocs d'haplotypes formés par les polymorphismes individuels dans les études d'associations. Par exemple, trois polymorphismes bialléliques peuvent former 8 (2 ) haplotypes différents et il est possible de tester si un de ces haplotypes est associé avec une faible densité osseuse. Une des limites des haplotypes est qu'il est impossible de déterminer
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la phase et donc l'haplotype exact des individus dont on ignore les génotypes des individus apparentés et qui sont hétérozygotes à plus d'un locus. Dans ce cas, les haplotypes doivent être estimés à l'aide de modèles statistiques, tel l'algoritme Maximisation-Expectation (EM) [163].
1.6.2 : Les différentes technologies de génotypage des SNPs.
Une bonne méthode de génotypage doit être simple à effectuer, peu coûteuse, avoir la capacité d'analyser rapidement plusieurs échantillons et générer peu d'erreurs de génotypage. [164]. Au cours des dernières années, la découverte de millions de SNPs a favorisé l'apparition de plusieurs dizaines de méthodes de génotypage. Ces techniques peuvent être divisées en différentes catégories selon le type de réactions biochimiques utilisées. Parmi les méthodes les plus populaires on retrouve les méthodes qui utilisent le principe d'hybridation d'un oligonucleotide allèle-spécifique (ASO) (ex : Taqman [165] [166], Molecular Beacons [167] [168]). Cette technique utilise un oligonucleotide complémentaire au variant allèlique dont le nucleotide complémeentaire est habituellement au milieu de la séquence de l'oligonucléotide. (figure 8 a). La stringence des conditions de réactions sont telles que seul les oligonucleotides parfaitement appariés restent stables et peuvent être détectés. Certaines méthodes utilisent le principe d'amplification d'ADN à l'aide d'amorces alleles spécifiques (figure 8 b). Cette technique utilise une amorce dont l'extrémité 3' est complémentaire au variant allèlique et dont l'appariement permet l'extension (par la ADN polymerase) d'une région d'ADN plus ou moins grande. La méthode d'amplification allèle-spécifique par PCR en plus d'utiliser une amorce allèle-spécifique, utilise une amorce commune en sens inverse qui permet l'amplification préférentielle d'un allele [169]. Dans ce cas, l'approche la plus simple pour détecter l'ADN amplifié est l'utilisation d'un colorant qui se liera spécifiquement aux doubles brins d'ADN des produits PCR [170]. D'autres méthodes vont utiliser le principe de ligation d'oligonucléotides qui utilise une amorce spécifique au variant génétique (extrémité 3'ou 5') et une amorce de ligation adjacente à l'amorce spécifique (figure 8 c). Lorsqu'il y a appariement parfait des amorces, les deux amorces seront liées ensemble à l'aide de la ligase. Les produits de ligation peuvent être détectés à l'aide d'une amorce de ligation liée à un fluorophore [168] ou à l'aide de microbilles [169] ou de micropuces [170]. Finalement, certaines méthodes vont utiliser les enzymes endonucléases de restriction. Les enzymes de restriction sont utilisées pour le clivage allèle-spécifique de l'ADN quand un SNP va altérer le site de reconnaissance de
l'enzyme. Les séquences sans mutation seront clivées, ou vice-versa, tandis que celles qui ont une mutation dans la séquence vont échouer à être clivées (figure 8 d).
Figure 8 : Description de 4 méthodes standards de génotypage : hybridation, ligation, extension d'ADN et enzyme de restriction [164].
b) Amplification d'ADN allèle-spécifique
a) Hvbndation a 5'' \ ■Atete-apedfic _ olgonucteotfcte "pr.tw "ïïïïflTÏÏ""M«>«* MhnÉdi iraUk b 4I4.-.[~:I... prrii-r. I DNA polymerase
;:nn.-"
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M38NP , d) Enzyme de restriction■nn
A'
JE::
jFjfrrrj;;;*^
c) LigationI
'SMTK
Aleb-speclic ligation probes A**.ent ' Igation probe 'Match. "Mismatch. u i li'i.it» l1.6.3 : Les erreurs de génotypage et les études d'association.
Bien qu'il y ait plusieurs nouvelles technologies de génotypage, toujours plus rapides et plus précises, aucune de ces méthodes n'est totalement à l'abri des erreurs de génotypage. La qualité des génotypes, outre la technologie utilisée, est influencée par plusieurs facteurs extérieurs, dont la qualité de l'ADN utilisé, le choix du SNP et l'expertise du laboratoire. Il est cependant important de contrôler la qualité du génotypage puisque de telles erreurs vont influencer les résultats des études
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d'association. Dans le cas des études d'association cas-témoins, les erreurs de génotypage vont diminuer la puissance statistique pour détecter une association vraie [171], principalement lorsque la fréquence du variant est faible [172]. Les erreurs de génotypage vont aussi avoir tendance à biaiser les résultats [173]. L'effet des erreurs de génotypage sur les études d'association avec trait quantitatif n'est pas très bien documenté. L'identification des erreurs de génotypage n'est pas simple, mais certaines solutions existent. Par exemple, l'utilisation d'un test statistique d'équilibre de Hardy- Weinberg qui compare la fréquence des génotypes obtenue avec la fréquence des génotypes prédite par la fréquence des alleles peut indiquer si des erreurs de génotypage se sont glissées dans nos génotypes. [174]
1.7 : Objectifs de travail
Puisque l'ostéoporose est une maladie complexe caractérisée par une faible densité osseuse qui est influencée par différents variants génétiques et que LIFR semble jouer un rôle significatif dans la régulation du métabolisme osseux, notre hypothèse de travail est que les variants de LIFR pourraient être en partie responsables des variations de densité osseuse observées dans la population. Le but de cette étude est donc de vérifier l'association entre les variants de LIFR et différentes mesures de densité osseuse dans une population de femmes canadiennes françaises.
Pour y arriver nous effectuerons les étapes suivantes :
♦ Identifier des polymorphismes (SNPs) susceptibles d'avoir un impact sur l'activité métabolique ou la production de LIFR et/ou qui représente le mieux la diversité génétique de LIFR à partir de la banque de donnée publique du « National Center for Biotechnology Information » (NCBI).
♦ Pour chaque polymorphisme sélectionné et validé dans la population étudiée, génotyper 2200 ou 5301 femmes à l'aide de la méthode de génotypage par amplification d'ADN allèle-spécifique : PCR-ASO.
♦ Pour chaque polymorphisme génotype, tester les associations entre cinq mesures osseuses et les polymorphismes individuels de LIFR à l'aide d'une analyse de covariance (ANCOVA) et avec les haplotypes à l'aide d'un modèle de régression linéaire (Haplo.score).