Un échantillon d'environ 6000 femmes mobiles vivant dans la région de la ville de Québec a été recruté via le Centre Ménopause Québec. Les femmes étaient recrutées à l'aide d'annonces placées dans différents journaux et d'activités de sensibilisation au problème de l'ostéoporose dans différents lieux publics. Foutes les femmes devaient préalablement répondre à un questionnaire, incluant des informations sur leurs habitudes de vie (cigarette, alcool, activités physiques, prise de produit laitier...), leur histoire médicale (état de santé, médicament, prise d'hormonothérapie) et leur histoire menstruelle (ménarche et ménopause) Les femmes devaient aussi fournir un échantillon de sang suffisant pour permettre une extraction d'ADN et des analyses de gènes candidats. Elles devaient aussi se soumettre à la prise de différentes mesures anthropométriques (taille, poids, circonférence de la taille, de l'abdomen et de la hanche) et de différentes mesures de densité osseuse.
2.2 : Critères d'inclusion et d'exclusion.
Pour être acceptées dans l'étude, toutes les femmes devaient avoir plus de 18 ans, être en santé et provenir d'une famille d'origine canadienne française depuis au moins trois générations. Les femmes atteintes d'une maladie degenerative osseuse ou du métabolisme phosphocalcique, ayant un désordre nutritionnel (gastrectomie, alcoolisme) ou une insuffisance hépatique ou rénale, prenant des médicaments influençant la formation de tissus osseux (didrocal, alendronate, calcitonine) étaient exclues de l'étude. Également, les femmes ayant un lien de parenté identifiable étaient exclues. Les femmes dont il manquait une variable nécessaire à l'étude étaient aussi exclues de l'étude. Toutes les informations nécessaires à l'exclusion ou l'inclusion d'un individu étaient recueillies à partir du questionnaire rempli préalablement.
2.3 : Mesures de densité osseuse.
Quatre mesures de densité osseuse différentes ont été recueillies. Deux mesures de densité osseuse obtenues avec la technique par ultrason quantitatif ont été prises au niveau du calcanéum droit, soit le « Broadband ultrasound attenuation » (BUA : dB/MHZ), le « Speed of sound » (SOS : m/s). L'index de « Stiffness » (Stiff) a aussi été calculé. Les mesures ultrasons ont été effectuées avec le densitomètre à ultrason Achiles™ (Lunar Corporation) avec un coefficient de variation pour les trois mesures
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inférieur à 1,5%. L'index de Stiffness est issu d'une combinaison entre les mesures BUA et SOS et est calculé à l'aide d'un programme fourni par le fabricant. Deux mesures de densité osseuse minérale mesurées avec un appareil d'absorptiométrie biphotonique à rayon X (DXA) (DPC-L Lunar Radiotion corporation) ont été prises au col fémoral (COL : g/cm2) et au rachis lombaire, entre la vertèbre 2 et 4 (L2L4 : g/cm2
). La méthode a démontré un coefficient de variation de moins de 1%. Toutes les femmes (5161 femmes) avaient les mesures de densité osseuse prises par ultrason et la moitié (2164 femmes) seulement avaient les mesures de densité osseuse minérale prises par DXA.
2.4 : Traitement de l'information des questionnaires, des mesures osseuses et gestion des échantillons de sang.
Les informations provenant des questionnaires, les mesures osseuses ainsi que le traitement des échantillons de sang ont été gérés via une base de données informatique pour réduire le nombre d'erreurs de manipulation. Les informations fournies par les questionnaires ont été saisies en double dans la banque de données par deux personnes différentes dans le but de limiter les erreurs de transcription des données. Un code numérique unique a été attribué à chaque femme. Ce code l'identifie dans une base de données informatique et la relie avec ses informations personnelles et ses mesures de densité osseuse. Ce code est utilisé également dans les processus informatiques de gestion des résultats de génotypage. Pour chacune des femmes de l'étude un échantillon sanguin est prélevé (1 tube de 10 mL et 1 tube de 5 mL). Le tube de 10 mL est utilisé pour prélever 200 ul de sang qui sera aliquoté dans des blocs en format 96-puits (Qiagen). Chacun des blocs de sang possède un code numérique unique qui l'identifie dans une base de données informatique. Ce code va relier les positions du bloc qui contiennent un échantillon de sang avec la femme qui a fourni l'échantillon. Par exemple, l'échantillon du bloc BaOOlO à la position A-10 sera relié automatiquement avec la femme qui possède le code Ba0010-A10 dans la base de données informatique. L'extraction d'ADN, ainsi que le génotypage seront également effectués dans des plaques 96-puits et le code unique ainsi que la position des échantillons sont conservés, ce qui permet de relier facilement les génotypes des femmes avec leurs informations personnelles.
2.5 : Extraction d'ADN génomique
L'extraction d'ADN se fait à partir des 200 ul de sang des blocs 96-puits et est effectuée avec la trousse commerciale QIAamp™ 96 DNA Blood (QIAGEN) selon le protocole (QIAamp 96 DNA blood KIT April 2000 1013683 04/2000) protocole fourni par le fabricant. Cette méthode permet l'extraction de l'ADN génomique directement à partir des leucocytes du sang à l'aide de colonnes qui ont un filtre de silice qui a la capacité de retenir l'ADN génomique et de le relâcher à un pH spécifique. Les 200 ul de sang sont déposés dans les puits des blocs et les échantillons sont traités avec 25 ul de protease K, une enzyme permettant la dégradation des protéines cellulaires. Les échantillons sont ensuite traités avec 200 ul de tampon de lyse (Buffer AL), suivi d'une légère agitation. Ils sont ensuite traités avec 200 ul d'éthanol 100% et à nouveau agités. Le lysat est ensuite déposé sur la colonne de filtration. La filtration s'effectue en centrifugeant (4 min, 6000 rpm). Les colonnes sont ensuite lavées consécutivement avec 500 ul de 2 tampons de lavage différents et centrifugés (Buffer AW1 : 2 min 6000 rpm et Buffer AW2 : 4min 6000 rpm). L'ADN génomique est ensuite élue avec 200 ul de tampon d'élution (Buffer AE) dans des blocs 96-puits qui sont conservés à -20°C comme échantillon « stock ».
2.5.1 : Préparation des solutions d'ADN pour le génotypage
Des volumes de 50 ul d'ADN des échantillons « stock » sont dilués dans 200 ul d'une solution 10 mM TRIS pH 7.8 et 0.05 mM EDTA contenant un colorant fluorescent inerte, le ROX. Le ROX (6-carboxy-X-rhodamine, Molecular Probes) est un fluorophore de couleur rose qui permet de vérifier la présence de la solution d'ADN (via ses propriétés de fluorescence) lors des étapes de génotypage et qui n'interfère pas avec les réactions PCR. La concentration de ROX finale est de 27 uM et la concentration moyenne d'ADN finale est estimée à environ 5ng/ul. La solution diluée est conservée à 4°C. La solution d'ADN diluée sera celle utilisée lors des étapes de génotypage par PCR.
2.6 : Sélection des polymorphismes intéressants à génotyper
J'ai sélectionné 12 SNPs à partir de la base de données publique de NCBI. La banque de données de NCBI contient la majorité des SNPs identifiés jusqu'à ce jour dans le domaine public via un mode de déclaration volontaire et est disponible sur le site internet de NCBI [175]. Le choix des SNPs intéressants à génotyper était basé sur leur capacité potentielle à influencer l'activité ou la production de la protéine, selon l'ordre
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de logique suivant : SNPs dans les régions codantes, SNPs dans les régions promotrices, SNPs dans les régions d'épissage et finalement SNPs dispersés à distance égale pour couvrir l'ensemble du gène. Les douze SNPs étaient situés dans la région génique de LIFR ou à l'extérieur du gène, à proximité de l'extrémité 5'. Les douze polymorphismes sélectionnés sont décrits dans le tableau 2.
Tableau 2: Caractéristiques des 12 polymorphismes sélectionnés dans la base de données publique de NCBI.
# d e référence
NCBI
Changement
nucleotide Changement acide aminé Position dans LIFR
Domaine/région de LIFR
rs3729732 C-T Arg-stop exon 2 liaison des cytokines I
rs3729734 C-T His-Tyr exon 5 liaison des cytokines I
rs3729740 G-A ASN-Asp exon 13 fibronectine type III
rs2303743 A-G Ile-Met exon 14 fibronectine type III
rs3729744 C-F Ser-Leu exon 14 fibronectine type III
rs3110234 G-A Val-Ile exon 17 fibronectine type III
rs3729751 C-T aucun exon 20 Cytoplasmique
rs2071237 C-G aucun
-210 pb en amont l'initiation de la
transcription région promotrice
rs3730266 A-G aucun exon 6 région d'épissage
rs2561819 T-A aucun intron 21 3'utr
r s 1 5 6 2 1 3 7 A-T aucun intron 1 5'utr
r s 3 7 5 6 4 2 1 C-T aucun intron 2 Aucun
2.7 : Génotypage des polymorphismes à l'aide de la méthode d'amplification d'ADN allèle-spécifique : PCR-ASO
2.7.1 : Résumé de la méthode de génotypage par amplification d'ADN allèle- spécifique : PCR-ASO.
Tous les génotypes ont été déterminés avec l'aide de la méthode d'amplification allèle- spécifique qui permet l'amplification de chaque allele séparément (PCR-ASO). Cette méthode nécessite deux réactions PCR distinctes effectuées dans 2 tubes différents, contenant deux amorces différentes (1 spécifique et 1 amorce commune). Chaque réaction permet l'amplification spécifique d'un allele grâce à une amorce complémentaire spécifique à la séquence de l'allèle à détecter. Chaque réaction contient aussi une amorce commune non spécifique qui permettra l'amplification de l'ADN. Les
deux amorces spécifiques ASO ne sont distinctes que par le dernier nucleotide en 3'. L'amorce commune est la même pour les deux réactions.
Lorsque l'amorce échoue à s'apparier (terminaison 3' de l'amorce est non complémentaire au gabarit génomique) et donc à amplifier de l'ADN, on en déduit que l'allèle recherché n'est pas présent chez cet individu. Par exemple, un individu homozygote rare aura une amplification d'ADN seulement pour la réaction spécifique à l'allèle rare et pas pour la réaction spécifique à l'allèle fréquent et un individu hétérozygote aura une amplification dans chacune des deux réactions. L'ADN amplifié est détecté avec l'aide du colorant fluorescent SYBR Green (Molecular Probes). Le SYBR Green est un agent intercalant qui a la particularité de s'intercaler à l'ADN double brin amplifiée par PCR et d'émettre un signal de fluorescence (538nm) quantifiable lorsqu'il est excité à une longueur d'onde de 485 nm. Le signal de fluorescence quantifié peut ensuite être utilisé pour attribuer un génotype à l'aide d'un graphique qui exprime la fluorescence associée aux deux réactions spécifiques. Bien qu'une quantité d'ADN génomique soit colorée par l'agent intercalant, celle-ci donne un signal fluorescent de 5 à 15 fois plus faible que lorsqu'il y a amplification. Le résumé de la méthode est illustré dans la figure 9.
À noter que notre méthode de génotypage a été testée sur 2500 génotypes en duplicata et qu'elle démontrait un taux de reproductibilité moyen de 99%. De plus, le génotypage de plus de 100 polymorphismes fait sur 90 à 180 duplicatas, nous a permis de confirmer que le taux moyen de génotypes rejetés était de moins de 1 %.
2.7.2 : « Design » des amorces.
La spécificité de la méthode d'amplification allèle-spécifique est obtenue grâce au « design » des 2 amorces spécifiques. Il est donc essentiel de bien déterminer la séquence de ces amorces. Pour distinguer les deux alleles d'un SNP, trois amorces différentes sont nécessaires :
> Deux amorces spécifiques dont la séquence est homologue à celle jouxtant le polymorphisme et varie d'un seul nucleotide à l'extrémité 3' en fonction de l'allèle à détecter. Les amorces spécifiques doivent idéalement être composées de
17 nucleotides et l'extrémité 3' devrait avoir un AG plus faible que l'extrémité 5'. > Une amorce commune aux deux alleles qui permettra l'amplification
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être composées de 21 nucleotides et produire un fragment de plus de 300 paires de bases lors de l'amplification. Elles doivent aussi être plus stables que l'amorce spécifique.
Le « design » des amorces a été effectué avec l'aide du programme informatique Oligo 4.0 (National Biosciences Inc). La séquence des amorces sélectionnées pour détecter les 12 SNPs est montrée dans le tableau 3.
Figure 9 : Résumé de la méthode de génotypage par amplification d'ADN allèle- spécifique par PCR.
ADN génomique