toiorce allele rare SYBBR Green I —
K
Amorce communeV* T
-*
Graphique de signal de fluoresence Amplification Signal de fluorescence Fluo. FréquentV^-c
Amplification Signal de fluorescence Homozygote fréquent C/C- ► *
x Fluo. Fréquent tarification Signal de fluorescence Fluo. Fréquent40
Tableau 3 : Séquences des amorces communes et spécifiques pour chacun des 12 polymorphismes sélectionnés initialement utilisés pour les étapes de mise au point et de génotypage.
SNPs #de référence
NCBI
Séquences des amorces Nombre de
nucleotides rs3729732 Amorce commune : CTTGATTGTGCTGGTGGTTAC
Amorces spécifiques : TATTTACGTATGTTTGAAAC(CZT)
21 20 rs3729734 Amorce commune : CAGCATCCGTTGAACATCATC
Amorces spécifiques : GTAGAACTTCCAAAAATCAT(GZA)
21 20 rs3729740 Amorce commune : GTGTCTTGGAGAAGCGTCTGA
Amorces spécifiques: AATGTATCGTGTTCATCA(GZA)
21 19 rs2303743 Amorce commune : CTCCCTTGCCCCCACCCTACC
Amorces spécifiques : CATCCCAACAACTTGTTC(TZC)
21 19 rs3729744 Amorce commune: CCACCCTGTCCCAGCCAGTGT
Amorces spécifiques: TGGTTCCGACCGAGAC(GZA)
21 17 rs3110234 Amorce commune :TCAAGGCCATCACTCTTCTCTC
Amorces spécifiques:GGTCGTTCTGACATAAAA(GZT)
21 19 rs3729751 Amorce commune: AAAGGAGTAAACGTCAGGCAA
Amorces spécifiques: TTTCAGAACAAACCAAA(CZT)
21 19 rs2071237 Amorce commune: GCTGTACCTGGAGGGCGATGAA
Amorces spécifiques: TGGACTCATGCTGCTG(GZC)
22 17 rs3730266 Amorce commune: GAGAGGGAAAAAGCATGTACT
Amorces spécifiques: GGAGCTCGTAAAATTAGT(AZG)
21 19 rs2561819 Amorce commune : AAACTCAAGATTGGGAGCTCT
Amorces spécifiques: ATACAGTAGGCACAGAAA(TZA)
21 19 rsl562137 Amorce commune: AAGGGCCTTCCAGCTTTCAAT
Amorces spécifiques: AGAGGTGACAGAAATGCT(AZT)
21 19 rsl562137
inverse
Amorce commune : AGGATGTTGCTGCTGGTACTG Amorces spécifiques: CATCTCACTGCCCCAT(TZA)
21 17 rs3756421 Amorce commune: TTGTAGGCTGACTTCCACTAC
Amorces spécifiques: GCTGGGGCTGGGTAGTTG(GZA)
21 20
2.7.3 : Validation des SNPs et optimisation des conditions PCR pour l'amplification allèle-spécifique de l'ADN.
Avant de commencer le génotypage de toute la cohorte, il est important de déterminer si les polymorphismes sélectionnés dans la banque de données NCBI sont présents dans la population étudiée avec une fréquence d'au moins 20%. Les polymorphismes étudiés devaient avoir une fréquence assez élevée pour avoir une puissance statistique suffisante et ainsi permettre la détection de l'effet minime d'un variant sur la densité osseuse. Il faut également sélectionner les conditions PCR (température d'appariement et nombre de cycles) optimales
qui permettront de différencier facilement les trois génotypes possibles, en minimisant le nombre de faux génotypes et de génotypes rejetés.
2.7.3.1 : Description des réactifs utilisés pour la méthode d'ampli ti cat ion d'ADN allèle- spécifique par PCR.
De la mise au point au génotypage complet de la cohorte, les volumes et les réactifs des réactions PCR sont identiques. Le volume final de chaque réaction PCR est de 15 ul et est composée de 5 ul (total de 5 ng/ul par individu) d'ADN génomique dilué dans du TE-ROX (10 mM TRIS pH 7,8 et 0,05 mM EDTA, Rox : 27 uM) et 10 ul de solution prémix PCR contenant 1,5 ul de tampon 10X Qiagen (contenant 15 nM de MgCbJ, 200 uM de chaque dNTP, 0,375 U de HotStarTaq DNA polymerase (Qiagen) et 3,75 pmol de chaque amorce. 2.7.3.2 : Détermination des conditions PCR optimales à l'aide d'un gradient de température.
Pour chaque polymorphisme choisi, nous avons effectué un PCR avec un gradient de température (T°C d'appariement) variant entre 50°C et 65°C avec 35 cycles consécutifs d'amplification à l'aide d'un thermocycleur MJ PTC-200 (MJ Research). Nous avons testé deux types d'ADN, dans deux réactions différentes, soit l'ADN d'un « pool » de 8 individus et l'ADN d'un seul individu, choisi aléatoirement parmi le « pool » de 8 individus. Dans le pool, la concentration d'ADN par individu est la même que pour la solution d'ADN avec un individu unique. L'ADN est dilué dans du TE-Rox et la concentration en ADN est de 5 ng/ul par individu (40 ng/ul pour le pool et 5 ng/ul pour l'individu seul). L'utilisation du pool de 8 ADN et donc de 16 chromosomes nous permet de détecter si le polymorphisme est présent dans la population avec une fréquence de plus de 20% avec une confiance de 97,2 %.
À l'exception des amorces, les réactifs et les conditions de PCR étaient les mêmes pour les 12 polymorphismes à valider. Les réactifs PCR de base sont ceux décrits à la section 2.7.3.1. Les conditions du PCR avec gradient de température sont les suivantes :
Denaturation initiale : 95°C, 15 minutes Nombre de cycles : 35
Denaturation : 95°C, 45 secondes
Appariement des amorces : Gradient de 50°C-65°C, 45 secondes Elongation : 72 °C, 45 secondes
Extension finale : 72°C, 5 minutes
À la fin de la période d'amplification, les produits PCR (amplicons) sont toujours irradiés aux rayons UV (X=312 nm) pendant 15 minutes dans le but d'éviter la contamination du
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laboratoire par les produits PCR. L'absorption de l'énergie des UV par l'ADN double brin entraîne la formation de dimères de thymines adjacentes qui provoque la distorsion de la double hélice, ce qui va empêcher l'amplification future des amplicons. Ensuite, 5 ul de SYBR Green (Molecular Probes, 100X) sont ajoutés manuellement aux produits PCR et la fluorescence du SYBR Green (Molecular Probes) est mesurée (excitation :485 nm et émission :538 nm) immédiatement avec un fluorimètre (Fluoroskan Ascent, Labsystem). La fluorescence émise par le ROX, déjà présent dans la solution d'ADN est aussi mesurée pour confirmer la présence de la solution d'ADN lors de l'amplification (excitation à 555 nm et émission à 612 nm). Suite à la lecture, les échantillons amplifiés sont aussi déposés sur gel d'agarose 1,5% (150 volt, 45 min, coloration : bromure d'éthidium) pour valider les signaux de fluorescence grâce à la taille du fragment d'ADN obtenu. Les résultats des signaux de fluorescence en fonction de la température d'amplification sont utilisés pour former un graphique dans une feuille Excel. Ce graphique est utilisé pour déterminer la température d'appariement idéale pour la prochaine étape de génotypage. Un exemple de graphique est montré à la figure 10. La tempéramre choisie doit être suffisamment élevée pour bien distinguer les deux alleles (éviter les faux positifs), mais suffisamment basse pour éviter que les réactions PCR échouent à démarrer lorsque l'allèle à détecter est réellement présent (éviter les faux négatifs). Lorsque aucune fluorescence significative n'est obtenue avec le pool d'ADN pour un des deux alleles d'un polymorphisme, on en déduit que ce variant n'est pas présent dans la population avec une fréquence de 20 % ou plus et le polymorphisme est mis de coté.
Figure 10: Graphique Excel des résultats des signaux de fluorescence en fonction de la température d'amplification utilisée pour déterminer la température d'appariement idéale. 9 0 0 800 700
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Lorsqu'un variant ayant une fréquence allèlique d'au moins 20 % est détecté (dans le pool d'ADN), lors de l'étape de mise au point par gradient et que les conditions préliminaires (T° d'appariement) ont été déterminées, ces conditions seront utilisées pour génotyper 16 individus différents, incluant les 8 individus du pool d'ADN utilisé pour le gradient. Lors de cette étape, le nombre de cycles initiaux de 35 peut être augmenté (habituellement à 37) pour améliorer la force du signal de fluorescence. Ce génotypage sur un petit nombre d'échantillons est effectué dans le but de vérifier la capacité des conditions initiales à distinguer clairement les différents génotypes possibles. Un volume de 5 ul d'ADN génomique (5 ng/ul) dilué dans du TE-Rox est utilisé pour chaque individu. Les PCR ASO sont effectuées avec un MJ PTC- 200 (MJ Research) avec les réactifs PCR de base décrits à la section 2.7.3.1. La température d'appariement et le nombre de cycles des 3 SNPs détectés lors de l'étape de mise au point et ayant donc une fréquence allèlique d'au moins 20 %, sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4: Séquence des amorces spécifiques, de la température d'appariement des amorces spécifiques et du nombre de cycles PCR en fonction de l'allèle et du polymorphisme à génotyper.
SNPs Séquence des amorces spécifiques 5'-» 3' Nombre
de cycles Température rs3110234 Fréquent : GGTCGTTCTGACATAAA A(G)
Rare: GGTCGTTCTGACATAAA A(A)
35 35 56°C rs2071237 Fréquent : TGGACTCATGCTGCTG(G) Rare : TGGACTCATGCTGCTG(C) 37 35 64°C rsl562137 Fréquent : AGAGGTGACAGAAATGCT(A) Rare : AGAGGTGACAGAAATGCT(T) 35 35 59°C rsl562137 Fréquent : CATCTCACTGCCCCAT(A) inverse R a r e . CATCTCACTGCCCCAT(T) 35 35 59°C
Note : 1 cycle de PCR : Denaturation initiale : 95°C, 15 minutes, Denaturation : 95°C, 45 secondes, Appariement des amorces : variable, 45 secondes, Elongation : 72 °C, 45 secondes, Extension finale : 72°C, 5 minutes.
À la suite de l'amplification d'ADN par PCR et de l'irradiation aux rayons UV, un volume de 5 ul de SYBR Green (Molecular Probes, 100X) est ajouté manuellement aux produits PCR et la fluorescence du SYBR Green et du ROX est immédiatement mesurée à l'aide d'un fluorimètre (Fluoroskan Ascent, Labsystem). Les produits PCR sont aussi déposés sur gel d'agarose 1,5% (150 volt, 45 min, coloration : bromure d'éthidium). Les mesures de fluorescence de SYBR Green obtenues pour les deux réactions sont utilisées pour créer un
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graphique avec Excel. Ce graphique sera utilisé pour déterminer si les conditions sont adéquates, permettant de regrouper clairement les 3 génotypes possibles. Un exemple de graphique est montré à la figure 11.
Figure 11: Graphique Excel utilisé pour la validation et l'optimisation des conditions PCR préliminaires effectué avec 16 ADN différents.