(Institut de biotechnologie Jacques Boy, Reims, France), 1 % de L-glutamine (Dominique Dutscher, Brumath, France) et 1 % de pénicilline/streptomycine/antifongique (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France).
B. Réactifs utilisés pour le traitement des cellules.
¾ SNAP ((±)-S-Nitroso-N-AcetylPenicillamine) (Calbiochem, VWR, Fontenay sous Bois, France)
Le SNAP est un donneur de NO (figure M1). Vingt milligrammes de SNAP sont repris dans 908 µl de diméthylsulfoxyde (DMSO) (Sigma Aldrich, Lyon, France) afin d’obtenir une solution stock d’une concentration de 100 mM. La solution stock ainsi reconstituée est aliquotée et conservée à -20°C. Ce composé étant sensible à la lumière, il est protégé de la lumière lors des manipulations.
¾ Ionomycine (Calbiochem, VWR, Fontenay sous Bois, France)
L’ionomycine est un ionophore produit par la bactérie Streptomyces conglobatus(figure M2). Elle est utilisée en recherche pour augmenter le niveau de calcium intracellulaire. Un milligramme d’ionomycine est repris par 1 ml de DMSO pour obtenir une concentration de 1,41 mM. Cette solution stock est aliquotée puis conservée à +4°C pendant un an. Ce composé étant sensible à la lumière, il est protégé de la lumière lors des manipulations.
¾ BAPTA/AM (1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetra (acetoxymethyl) ester) (Calbiochem, VWR, Fontenay sous Bois, France)
Le BAPTA/AM (figure M3) est une forme de BAPTA qui peut traverser les membranes cellulaires. Une fois chargé dans les cellules, il est hydrolysé par les estérases cytoplasmiques et se trouve sous la forme active du chélateur de calcium BAPTA. Vingt-cinq milligrammes de BAPTA/AM sont repris par 2,5 ml de DMSO pour obtenir une solution stock à 13 mM aliquotée et conservée à -20°C pendant un mois. Ce composé étant sensible à la lumière, il est protégé de la lumière lors des manipulations.
¾ TSH (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Dix unités de TSH bovine lyophilisée sont solubilisées dans 10 ml d’eau stérile. Cette solution stock de TSH à 1 U/ml est aliquotée et stockée à -20°C.
¾ siRNA PRC/témoin et SilencerTM siRNA Transfection Kit II (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)
Quarante nanomoles de siRNA (small interfering RNA) sont reprises dans 800 µl d’eau stérile pour obtenir une solution à 50 µM. Cette solution est aliquotée et stockée à -20°C. Pour transfecter le siRNA dans les cellules, l’agent de transfection siPORT NeoFX du kit SilencerTM siRNA Transfection Kit II a été utilisé. Celui-ci est stocké à +4°C. Il est constitué de liposomes dans une proportion adaptée à un moindre stress de la cellule. Ces liposomes permettent une néofection, c'est-à-dire qu’il est possible de synchroniser le cycle cellulaire au moment de la transfection. Le siRNA témoin utilisé correspond à un « scramble » universel testé pour être inefficace quelque soit le gène cible invalidé.
II. Inhibition de l’expression de PRC par siRNA.
Afin d’inhiber l’expression de PRC dans les cellules XTC.UC1 selon le principe d’ARN interférence décrit dans la figure M4, trois siRNAs ont été testés en comparaison à un témoin négatif (scramble, N° 4635). Le siRNA PRC N° 121729 a été choisi car son introduction dans les cellules permet une inhibition d’au moins 70 % de l’expression de l’ARNm de PRC dans les cellules XTC.UC1 après 48 h.
Les cellules préalablement synchronisées par privation de sérum sont décollées par l’action de la trypsine puis resuspendues à une concentration de 1.105 cellules/ml dans du milieu de culture. En parallèle, les complexes ARN/agent de transfection sont préparés. L’agent de transfection siPORT NeoFX est dilué à raison de 5 µl de solution stock dans 100 µl de milieu OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) préalablement incubé pendant 10 minutes à température ambiante. Le siRNA PRC ou contrôle est dilué à une concentration finale de 30 nM dans 100 µl de milieu OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium. Puis l’agent de transfection dilué et l’ARN dilué sont mélangés et ce mélange est incubé à température ambiante pour permettre aux complexes de transfection de se former. Deux cent microlitres de ce mélange sont ensuite distribués dans chaque puits d’une plaque 6 puits (Falcon, Becton-Dickinson, le Pont de Claix, France) puis 2,3 ml de suspension de cellules (soit 2,3.105 cellules) sont ajoutés dans le puits. La plaque est doucement agitée puis placée dans l’étuve à 37°C pendant 7 heures. Ce mélange de transfection est ensuite enlevé et les cellules sont incubées dans du milieu de culture contenant 20 % de sérum de veau fœtal
dans l’étuve à 37°C pendant 24, 48 ou 72 h puis les cellules sont récupérées afin de réaliser une extraction d’ARN, d’ADN ou de protéines par la suite.
III. Extraction des ARNs totaux à partir de cellules.
Les ARNs totaux sont extraits à l’aide du kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France).
Un culot sec de cellules congelées est d’abord lysé et homogénéisé dans 600 µl de tampon RLT additionné de 10 µl d’une solution de 98 % de beta-mercaptoéthanol (Sigma Aldrich, Lyon, France). Ce tampon très dénaturant, fortement concentré en thiocyanate de guanidine, inactive les RNases, ce qui permet la purification d’ARNs intacts. Le lysat est transféré sur une colonne QIAshredder permettant l’élimination des agrégats et débris cellulaires (figure M5). Après une centrifugation de deux minutes à 10000 g, le lysat est récupéré dans le tube collecteur placé sous la colonne.
Au lysat, 600 µl d’éthanol à 70 % sont ajoutés et le tout est transféré sur une colonne de silice RNeasy placée sur un tube collecteur. Cette étape permet de retenir les ARNs sur la colonne et d’éluer les contaminants. Après 15 secondes de centrifugation à 10000 g, l’éluat est éliminé puis trois lavages avec centrifugation sont effectués : un lavage avec 700 µl de tampon RW1 (contenant une petite quantité de thiocyanate de guanidine) suivi de deux lavages avec 500 µl de tampon RPE. Une dernière centrifugation est effectuée sans tampon afin d’éliminer complètement l’excédent de tampon et d’alcool de la colonne.
Les ARNs totaux sont ensuite élués par ajout de 30 à 40 µl d’eau stérile (dépourvue de RNases) sur la colonne puis centrifugation pendant une minute à 10000 g.
La concentration des ARNs totaux obtenus est mesurée à l’aide du spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 (Nyxor Biotech, Labtech, Palaiseau, France). La densité optique (DO) des échantillons est lue à 260 nm (longueur d’onde d’absorption des bases puriques et pyrimidiques) et à 280 nm (longueur d’onde d’absorption des protéines). La pureté des échantillons est évaluée par le rapport DO260/DO280 : celui-ci doit être supérieur à 1,8. Les échantillons d’ARN en solution sont alors conservés à -80°C.
IV. Extraction d’ADN.
L’ADN est extrait à l’aide du BioRobot EZ1 et du kit EZ1 DNA tissue kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Le culot cellulaire est remis en suspension dans 190 µl de tampon G2 auxquels 10 µl de protéinase K sont ajoutés. Le mélange est incubé pendant 15 minutes à 56°C. Ce lysat est ensuite placé dans le robot qui va isoler l’ADN du lysat en une étape par liaison de l’ADN à des billes de silice magnétiques en présence d’un tampon chaotropique. Les billes sont séparées du lysat à l’aide d’un aimant. L’ADN est ensuite lavé puis élué dans 200 µl de tampon. Les échantillons d’ADN ainsi obtenus sont conservés à -20°C.
V. Transcription inverse (RT).
La transcription inverse permettant la synthèse d’un brin d’ADN complémentaire (ADNc) à partir d’une matrice ARNm grâce à une reverse transcriptase rétrovirale (MMLV : Moloney-Murine Leukemia Virus) est réalisée à l’aide du kit Advantage® RT-for-PCR kit (Clontech, Ozyme, Montigny Le Bretonneux, France).
Un volume correspondant à 2 µg d’ARN total est utilisé. De l’eau contenant du diethylpyrocarbonate (DEPC, permettant la dégradation des RNases) est ajoutée afin d’obtenir un volume de 12,5 µl. Des hexamères d’amorces (1 µl) sont ajoutés au mélange et le tout est chauffé à 72°C pendant 2 min puis la réaction est stoppée en plaçant les tubes dans la glace. Les composés suivants sont ensuite ajoutés dans chaque tube :
- 4 µl de tampon de réaction 5X (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, contenant 375 mM de KCl et 15 mM de MgCl2)
- 1 µl de mélange de dNTPs (10 mM de chaque) - 0,5 µl d’inhibiteur de RNases (RNasin)
- 1 µl de transcriptase inverse MMLV
La réaction de transcription inverse est alors réalisée en incubant les tubes à 42°C pendant une heure. Les tubes sont ensuite chauffés à 94°C pour stopper la réaction de synthèse des ADNs complémentaires et détruire toute activité DNAse. Les échantillons d’ADNc sont ensuite dilués en ajoutant 130 µl d’eau DEPC puis congelés en aliquots à -20°C.