B. Réactifs
XV. Détection de protéines par Western-Blot
XV. Détection de protéines par Western-Blot.
A. Principe de la technique.
Cette technique permet de déterminer la présence ainsi que la quantité relative d’une protéine dans un échantillon. Le motif antigénique de la protéine d’intérêt est reconnu par un anticorps primaire dirigé contre cette protéine. Un anticorps secondaire (immunoglobuline G non spécifique) couplé à la peroxydase reconnaît ensuite l’anticorps primaire. Pour finir, la révélation du complexe antigène/anticorps se fait par chimioluminescence.
B. Réactifs.
¾ Tampon Tris-SDS pH 8,8.
Réactif Concentration finale Masse à peser
Tris 1 M 12,12 g
SDS 20 % 0,20 g
De l’eau distillée est ajoutée pour obtenir un volume de 100 ml de tampon. Celui-ci est ajusté à pH 8,8 avec de l’HCl 5N puis conservé à +4°C.
¾ Tampon Tris-SDS pH 6,8.
Réactif Concentration finale Masse à peser
Tris 300 mM 3,63 g
SDS 20 % 0,20 g
De l’eau distillée est ajoutée pour obtenir un volume de 100 ml de tampon. Celui-ci est ajusté à pH 6,8 avec de l’HCl 5N puis conservé à +4°C.
¾ Tampon d’échantillon 2X.
Réactif Concentration finale Masse à peser/volume
Tampon Tris-SDS pH 6,8 100 mM 10 ml
SDS 1,2 % 1,2 g
Glycérol 4,1 M 37,8 g
Bleu de bromophénol 1 % 28,9 µM 2 mg
De l’eau distillée est ajoutée pour obtenir un volume de 100 ml de tampon puis celui-ci est conservé à +4°C.
¾ Tampon d’électrophorèse 10X.
Réactif Concentration finale Masse à peser
Tris 250 mM 30,3 g
Glycine 1,92 M 144 g
SDS 1 % 10 g
De l’eau distillée est ajoutée pour obtenir un volume de 1000 ml de tampon. Celui-ci est ajusté à pH 8,3 avec de l’HCl 5N puis conservé à +4°C. Ce tampon est dilué au 1/10ème dans de l’eau distillée avant son utilisation.
¾ Tampon de transfert.
Réactif Concentration finale Masse à peser/volume
Tris 20 mM 2,4 g
Glycine 150 mM 11,3 g
Ethanol 20 % 200 ml
De l’eau distillée est ajoutée pour obtenir un volume de 1000 ml de tampon. Celui-ci est ajusté à pH 8,3 avec de l’HCl 5N puis conservé à +4°C.
¾ Tampon TBS (Tris Buffered Saline) 10X.
Réactif Concentration finale Masse à peser
NaCl 1,37 M 81 g
KCl 25,5 mM 1,9 g
Tris 250 mM 30,3 g
De l’eau distillée est ajoutée pour obtenir un volume de 1000 ml de tampon. Celui-ci est ajusté à pH 7,4 avec de l’HCl 5N puis conservé à +4°C. Avant son utilisation, ce tampon est dilué au 1/10ème dans 1000 ml d’eau distillée auxquels 1 ml de Tween 20 (Sigma Aldrich, Lyon, France) est ajouté pour obtenir le tampon TBS/Tween 20.
¾ Anticorps.
Nom Fournisseur Dilution finale
Anti-nitrotyrosines Abcam 1/250ème
Į-tubuline Sigma Aldrich 1/1000ème
OXPHOS Mitosciences 1/500ème
C. Protocole.
¾ Préparation des échantillons.
Chaque culot cellulaire est repris par 20 µl d’eau distillée auxquels sont ajoutés 0,2 µl d’antiprotéases 100X (Protease inhibitor mix, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Orsay, France). La concentration en protéines de chaque échantillon est ensuite dosée à l’aide du Nanodrop ND-1000 qui mesure l’absorbance des protéines à 280 nm. Un volume équivalent à 40 µg de protéines totales est prélevé et le même volume de tampon d’échantillon 2X y est ajouté. Afin de dénaturer les interactions protéiques, le mélange est ensuite chauffé à 95°C pendant 10 minutes (sauf lorsque l’on veut détecter la protéine COX I car celle-ci est sensible à la chaleur, dans ce cas, l’échantillon n’est pas chauffé) puis déposé sur gel d’acrylamide.
¾ Préparation du gel d’acrylamide.
La concentration d’acrylamide à utiliser dans le gel varie selon la taille des protéines d’intérêt. Dans nos expériences, le poids moléculaire des protéines à étudier allant de 20 kDa à 50 kDa, un gel de séparation à 12,5 % d’acrylamide a été utilisé. Pour deux gels, 12,5 ml de tampon Tris-SDS pH 8,8 ont été ajoutés à 10,4 ml d’acrylamide stock à 30 % (BioRad, Marnes La Coquette, France) et à 2 ml d’eau distillée. La polymérisation de l’acrylamide est alors déclenchée par ajout de 250 µl de persulfate d’ammonium (Eurobio, Les Ulis, France) à 10 % et de 12,5 µl de TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine ; N,N,N',N'-Di-(dimethylamino)ethane ; N,N,N',N'-Tetramethyl-1-,2-diaminomethane ; Eurobio, Les Ulis, France). Le gel est alors immédiatement coulé entre deux plaques de verres et la surface de chaque gel est lissée par ajout d’1 ml d’isopropanol (Merck, VWR, Fontenay sous Bois, France). Pendant la polymérisation, le gel de concentration (à 3 % d’acrylamide) est préparé. Pour cela, 5 ml de tampon Tris-SDS pH 6,8 et 1 ml d’acrylamide stock sont mélangés à 4 ml d’eau distillée. Après polymérisation du gel de séparation à 12,5 % d’acrylamide (environ 30 minutes), l’isopropanol est retiré par renversement du système de coulage des gels. Cent
microlitres de persulfate d’ammonium et 10 µl de TEMED sont ajoutés au mélange du gel de concentration et ce dernier est immédiatement coulé au-dessus du gel de séparation et les peignes sont mis en place. Après 30 minutes de polymérisation, le système de coulage est démonté et les gels sont placés dans la cuve à électrophorèse. Environ 500 ml de tampon d’électrophorèse sont ajoutés entre et autour des deux gels et les peignes sont retirés.
¾ Dépôt des échantillons et migration.
Cette étape a pour but de séparer les protéines des échantillons selon leur poids moléculaire. Après dénaturation, les échantillons de protéines sont déposés dans les puits. Un marqueur de poids moléculaire (Precision Plus Protein Dual Color Standards, BioRad, Marnes La Coquette, France) est également déposé pour suivre la migration. La cuve d’électrophorèse (BioRad, Marnes la Coquette, France) est fermée et reliée au générateur (PowerPac HC, BioRad, Marnes la Coquette, France). Une première migration de 20 minutes à 100 V est alors réalisée afin de concentrer les échantillons dans le gel de concentration. Cette étape est suivie par une seconde migration d’1h30 à 140 V afin de séparer les protéines. Celles-ci étant rendues électronégatives par le SDS, elles se sépareront en fonction de leur masse moléculaire et non pas en fonction de leur charge électrique, d’autant plus loin de la ligne de départ que leur masse est faible. Lorsque le front de migration atteint le bas du gel, la migration est stoppée.
¾ Transfert sur membrane de PVDF.
Cette étape permet le transfert des protéines contenues dans le gel sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) (Amersham Hybond-P, GE Healthcare, Orsay, France). La membrane est placée pendant 15 secondes dans un bain d’éthanol absolu afin d’être ionisée puis rincée 5 minutes dans de l’eau distillée puis équilibrée 30 secondes dans le tampon de transfert. Pendant ce temps, le gel est démoulé et placé dans l’appareil de transfert (Trans-Blot SD, BioRad, Marnes la Coquette, France) sur 3 épaisseurs de papier buvard (Whatman, VWR, Fontenay sous Bois, France) imbibé de tampon de transfert. La membrane est déposée sur le gel et est recouverte à son tour de deux épaisseurs de papier buvard imbibé de tampon de transfert. Le transfert des protéines sur la membrane est alors réalisé par application d’un courant de 260 mA pendant une heure.
¾ Saturation de la membrane.
Afin de saturer les sites de fixation non spécifiques, la membrane est placée dans une solution de saturation composée de 5 % de lait écrémé repris dans du tampon TBS/Tween 20, sous agitation pendant une nuit à +4°C (ou 3 heures à température ambiante).
¾ Incubation de la membrane avec l’anticorps primaire.
La membrane est rincée 3 fois pendant 5 minutes dans un bain de TBS/Tween 20 puis incubée dans la solution d’anticorps primaire (dilué à la concentration voulue dans du TBS/Tween 20/lait 1 %) pendant 3 heures à température ambiante (ou une nuit à +4°C).
¾ Incubation de la membrane avec l’anticorps secondaire.
Après trois rinçages de 5 minutes dans du TBS/Tween 20, la membrane est incubée pendant 2 heures dans la solution d’anticorps secondaire (anticorps dilué au 1/20000ème dans du TBS/Tween 20/lait 1 %) dirigé contre les immunoglobulines G de l’anticorps primaire et couplé à la peroxydase.
¾ Révélation.
L’hybridation des anticorps sur la membrane est révélée par chimioluminescence à l’aide du kit AmershamTM ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, Orsay, France). Après incubation avec l’anticorps secondaire, la membrane est rincée deux fois 5 minutes avec du tampon TBS/Tween 20 puis une fois avec du tampon TBS. Un mélange contenant 2 ml de la solution A du kit ECL Plus et 50 µl de la solution B est déposé uniformément sur la membrane. Après 5 minutes d’incubation à l’abri de la lumière, l’excès de réactif est retiré de la membrane et celle-ci est placée dans l’appareil de détection (ChemiDoc XRS, BioRad, Marnes la Coquette, France). Différents temps d’exposition sont réalisés jusqu’à l’obtention de bandes d’intensité satisfaisante mais non saturante.
¾ Quantification.
L’intensité des différentes bandes est quantifiée grâce au logiciel Quantity One (ChemiDoc XRS, BioRad, Marnes la Coquette, France). Les résultats concernant la protéine d’intérêt sont normalisés par rapport à la quantité de la protéine de référence, ici l’Į-tubuline.