B. Réactifs
VIII. Dosage de l’activité de la succinate ubiquinone réductase (complexe II) sur cellules
Les cuves sont placées dans le spectrophotomètre (Beckman U 640B, Beckman Coulter, Roissy CDG, France) thermostaté à 37°C et la cinétique de décroissance de l’absorbance à 340 nm est suivie pendant 40 secondes. Sans stopper la lecture, 6 µl de roténone à 0,5 mM sont ajoutés dans chaque cuve et après homogénéisation avec le cône, l’absorbance est suivie à nouveau pendant 40 secondes. La lecture est ensuite arrêtée et les pentes de décroissance sont notées :
- la pente initiale avant l’ajout de roténone - la pente après l’ajout de roténone.
¾ Calcul de l’activité du complexe I.
L’activité du complexe I est calculée en utilisant la formule suivante :
ǻDO(-R) - ǻDO(+R) Vtotal
Activité spécifique : AS (cell) = x
l x εεεεNADHx Sn NADH q cellules
ǻDO(-R) : delta DO par minute mesurée avant addition de roténone
ǻDO(+R) : delta DO par minute mesurée après addition de roténone
l : longueur de traversée du faisceau optique en cm, soit 1 ε
ε ε
εNADH : coefficient d’extinction du NADH à 340 nm et pH 7,4, en mM-1.cm-1, soit 6,22
Sn NADH : nombre stœchiométrique du NADH dans l’équation de la réaction, soit 1
q cellules : quantité de cellules ajoutée dans le mélange réactionnel, soit 0,5 million
Les résultats ainsi obtenus sont exprimés en nmoles/min/million de cellules.
VIII. Dosage de l’activité de la succinate ubiquinone réductase (complexe
II) sur cellules.
A. Principe de la technique.
La réaction enzymatique catalysée par le complexe II est la suivante :
Lors de cette réaction, le succinate réduit l’ubiquinone en ubiquinol. Le dosage fait intervenir une seconde réaction impliquant un composé chimique de couleur bleue, le DCPIP qui absorbe la lumière à 600 nm. Ce dernier va être réduit par l’ubiquinol-2 formé lors de la réaction précédente. Le DCPIP va alors perdre sa couleur bleue et ne va plus absorber de lumière. La réaction permettant de doser l’activité du complexe II va donc consister à suivre la décroissance de l’absorbance du DCPIP à 600 nm, celle-ci étant proportionnelle à l’ubiquinol formé.
B. Réactifs.
¾ Tampon KH2PO4 100 mM, pH 7,5 (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Les 1,36 g de KH2PO4 sont dissous dans 100 ml d’eau distillée et le pH est ajusté à 7,5 avec du KOH 5N. Ce réactif, une fois aliquoté, se conserve pendant 6 mois à -20°C.
¾ Ubiquinone-1 (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Dix milligrammes d’ubiquinone-1 sont repris par 1 ml d’éthanol absolu pour constituer une solution stock à 39,9 mM. Avant chaque expérience, 100 µl de cette solution sont ajoutés à 1,398 ml d’éthanol absolu pour obtenir une concentration de 2,5 mM. La solution stock est stable pendant un mois à -20°C mais doit être protégée de la lumière.
¾ Acide succinique (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Une solution à 500 mM est préparée en dissolvant 29,5 mg d’acide succinique dans 1 ml d’eau distillée puis, après ajustement du pH à 7 avec du KOH 5N, de l’eau distillée est ajoutée à cette solution pour obtenir un volume de 2 ml. La solution ainsi obtenue se conserve en aliquots pendant 1 mois à -20°C.
¾ Acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Pour préparer la solution d’EDTA à 20 mM, 14,89 mg d’EDTA sont dissous dans 1 ml d’eau distillée puis le pH est ajusté à 7 avec du KOH 5N et de l’eau distillée est ajoutée à cette solution pour obtenir un volume final de 2 ml. La solution ainsi obtenue est stable pendant 6 mois à -20°C.
¾ Cyanure de potassium (KCN) (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Cet inhibiteur est spécifique du complexe IV. Une solution à 10 mM est préparée en reprenant 6,4 mg de cyanure de potassium par 10 ml d’eau distillée. Une fois aliquotée, cette solution peut être conservée pendant 1 mois à -20°C.
¾ Albumine de sérum bovin sans acides gras libres (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Deux cent cinquante milligrammes d’albumine de sérum bovin sont dilués dans 5 ml d’eau distillée. La solution à 50 mg/ml ainsi préparée est stable pendant 6 mois à -20°C.
¾ Dichlorophenolindophenol (DCPIP) (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Le jour de l’expérience, 5,80 mg de DCPIP sont repris par 4 ml d’eau distillée et cette solution à 5 mM est placée à 37°C jusqu’à utilisation.
¾ Triton X-100 (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Le triton X-100 est conservé à 4°C. La veille du dosage, il est placé à température ambiante. Puis, une solution à 10 % est préparée en diluant 1 ml de triton X-100 dans 9 ml d’eau distillée. Ce réactif se conserve pendant 6 mois à -20°C.
¾ Antimycine A (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Il s’agit d’un inhibiteur du complexe III. Le contenu du flacon (10 mg) est dilué dans 20 ml d’éthanol absolu pour obtenir une solution à 0,5 mg/ml qui est conservée pendant 1 mois à -20°C.
¾ Roténone (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Ce réactif est un inhibiteur du complexe I. Deux milligrammes de roténone sont repris par 2 ml d’un mélange volume à volume d’éthanol absolu et de DMSO. Cette solution à 2,5 mM se conserve 1 mois à -20°C en aliquots.
¾ Thénoyltrifluoroacétone (Sigma Aldrich, Lyon, France)
Une solution à 40 mM est préparée en dissolvant 8,8 mg de thénoyltrifluoroacétone dans 1 ml d’éthanol absolu, elle peut être utilisée pendant 3 mois après stockage à -20°C.
C. Protocole.
¾ Préparation des cellules.
Ce protocole est réalisé à partir de culots secs de cellules (au moins 2 millions de cellules) conservés à -80°C. Le culot, une fois décongelé est repris par 50 µl de tampon A par million de cellules (composition : cf dosage de l’activité du complexe I) et placé pendant 3 minutes dans l’azote liquide. Le culot est ensuite rapidement décongelé au bain marie à 37°C. Cette étape permet d’éclater les cellules. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée à 16000 g pendant 30 secondes et le culot est repris par 50 µl de tampon A par million de cellules.
¾ Mesure de l’activité du complexe II par spectrophotométrie.
Le dosage de l’activité du complexe II doit être réalisé juste après préparation des cellules.
Le mélange réactionnel est préparé dans des tubes en verre :
Réactif Volume Concentration finale
KH2PO4 100 mM pH 7,5 500 µl 50 mM Eau distillée 160 µl
EDTA 5 µl 0,1 mM
Albumine de sérum bovin 20 µl 1 mg/ml
Cyanure de potassium 200 µl 2 mM Roténone 4 µl 0,01 mM Antimycine A 4 µl 0,002 mM Acide succinique 40 µl 20 mM DCPIP 16 µl 0,08 mM Triton X-100 10 % 2 µl 0,02 %
Chaque dosage est effectué en duplicat. Ce mélange est incubé pendant 2 minutes à 37°C. Vingt-cinq microlitres de la suspension cellulaire (soit 0,5 million de cellules) sont ajoutés puis la réaction est déclenchée par l’ajout de 20 µl d’ubiquinone-1 à 2,5 mM. Le mélange est ensuite rapidement transvasé dans des microcuves à usage unique (CML, Nemours, France). Les cuves sont placées dans le spectrophotomètre (Beckman U 640B, Beckman Coulter, Roissy CDG, France) thermostaté à 37°C et la cinétique de décroissance de l’absorbance du DCPIP à 600 nm est suivie pendant 90 secondes. Sans stopper la lecture, 5 µl de thénoyltrifluoroacétone à 40 mM sont ajoutés dans chaque cuve et après homogénéisation
avec le cône, l’absorbance est suivie à nouveau pendant 90 secondes. La lecture est ensuite arrêtée et les pentes de décroissance sont notées :
- la pente initiale avant l’ajout de thénoyltrifluoroacétone - la pente après l’ajout de thénoyltrifluoroacétone.
¾ Calcul de l’activité du complexe II.
L’activité du complexe II est calculée en utilisant la formule suivante :
ǻDO(-T) - ǻDO(+T) Vtotal
Activité spécifique : AS (cell) = x
l x εεεεDCPIPx Sn DCPIP q cellules
ǻDO(-T) : delta DO par minute mesurée avant addition de thénoyltrifluoroacétone
ǻDO(+T) : delta DO par minute mesurée après addition de thénoyltrifluoroacétone
l : longueur de traversée du faisceau optique en cm, soit 1 ε
ε ε
εDCPIP : coefficient d’extinction du DCPIP à 600 nm et pH 7,5, en mM-1.cm-1, soit 19,1
Sn DCPIP : nombre stœchiométrique du DCPIP dans l’équation de la réaction, soit 1
q cellules : quantité de cellules ajoutée dans le mélange réactionnel, soit 0,5 million
Les résultats ainsi obtenus sont exprimés en nmoles/min/million de cellules.