Quantification du greffage de la Streptavidine

4.5.1. Influence de la durée d’incubation.

L’évolution de la concentration de Streptavidine dans le surnageant a été mesurée en fonction de la durée d’incubation, étudiée entre 1 h et 30 h, est présentée sur la Figure 84. Les échantillons sont préparés par ajout de 1,25 µL de Streptavidine fluorescent avec 500 µL de solution colloïdale de nanoparticules de CuO (courbe rouge), ou d’Al (courbe noire). La concentration initiale en Streptavidine dans le surnageant est donc établie à 2,5 µg.mL-1, confirmée par mesure d’un échantillon témoin (2,48 ± 0,04 µg.mL-1), et matérialisée par la ligne pointillée sur la Figure 84.

Figure 84 : Concentration en Streptavidine dans le surnageant d’une solution colloïdale de CuO (courbe rouge) et d’Al (courbe noire) en fonction de la durée d’incubation. La concentration initiale en Streptavidine est matérialisée à 2,5.10-3 mg.ml-1 par la ligne pointillée. Les barres d’erreurs sont calculées par propagation des incertitudes.

On observe que la concentration en Streptavidine dans le surnageant est inférieure à la concentration initiale de 2,5 µg.mL-1 dans les deux cas, et est globalement stable quelle que soit la durée d’incubation à 1,9 ± 0,1 µg.mL-1 pour CuO, et 1,8 ± 0,1 µg.mL-1 pour Al. Le minimum est obtenu après 3 h et 14 h d’incubation (1,75 µg.mL-1) et le maximum après 8 h et 30 h d’incubation (2,01 µg.mL-1).

La différence entre la quantité de Streptavidine initiale (2,5 µg.mL-1) et la quantité de Streptavidine dans le surnageant (1,9 µg.mL-1) permet de déterminer la quantité de Streptavidine éliminée avec la centrifugation, et donc greffée à la surface des particules. Afin d’exploiter ces résultats, il est nécessaire de normaliser cette quantité de Streptavidine calculée par la concentration en nanoparticules de CuO et Al déterminée par AAS. Les résultats du nombre de protéines en fonction de la durée d’incubation sont présentés dans la Figure 85 ci-dessous.

Figure 85 : Evolution du nombre de Streptavidine greffées sur les nanoparticules de CuO (courbe rouge) et d’Al (courbe noire) en fonction de la durée d'incubation. Les barres d’erreurs sont calculées par propagation des incertitudes.

Globalement, la densité de greffage est constante à 940 ± 200 et 860 ± 215 protéines par nanoparticule, pour CuO et Al respectivement, quelle que soit la durée d’incubation, bien que les écarts types soient importants (entre 20 et 25 %). On constate en effet que l’on greffe entre 500 et 1 400 protéines par nanoparticule, représentant une surface de recouvrement de 9 à 15 % pour le CuO et entre 7 et 12 % pour l’Al, en considérant comme taille de la Streptavidine ses dimensions caractéristiques de 4 × 4,2 × 5 nm3 (Weber et al., 1989). La densité atteint un maximum à 1 300 ± 160 protéines par nanoparticules après 14 h d’incubation pour le CuO, et 1 150 ± 160 protéines par nanoparticules pour l’Al, puis se stabilise à une valeur plus basse à 750 ± 150 protéines par nanoparticule pour de longues durée d’incubation (supérieures à 18 h). Ces valeurs de recouvrement correspondent à une densité de greffage surfacique de (7,3 ± 1,2) × 1011

et (5,3 ± 1,3) × 1011 protéines par cm² pour les nanoparticules de CuO et d’Al respectivement. Elles sont comparables avec les valeurs de 4,6 × 1011 protéines par cm² obtenues par l’équipe de Castelino (Castelino et al., 2005).

De façon générale, ces résultats nous indiquent que le greffage de la Streptavidine est rapide et spontané à température ambiante. La densité est répétable, bien que les écarts types soient importants à cause d’incertitudes sur le nombre de nanoparticules en solution et la concentration en Streptavidine déterminée de façon indirecte.

4.5.2. Influence de la concentration saline

L’influence de la concentration saline étuiée entre 0, 15, 70 et 140 mM en NaCl sur la densité de greffage de la Streptavidine après 8 h d’incubation est donnée en Figure 86.

0 5 10 15 20 25 30 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 CuO Al P ro té in es p ar NP ( # .NP -1 ) Durée d'incubation (h)

Figure 86: Nombre de Streptavidine greffées sur les nanoparticules d’Al et de CuO en fonction de la concentration saline du solvant de dispersion, après 8 h d’incubation. Les barres d’erreurs sont calculées par propagation des incertitudes.

Pour le CuO, le nombre de protéines par nanoparticules est constant, à environ 500 protéines par nanoparticule, quelle que soit la concentration saline entre 0 et 70 mM. Cependant, la quantité de Streptavidine diminue d’un facteur 2 lorsque la concentration est augmentée à 140 mM. Notons qu’à cette concentration, le potentiel Zeta diminue à -20,5 ± 0,9 mV. Ceci implique que la répulsion électrostatique entre particules de CuO est trop faible, et qu’une agrégation de nanoparticules est induite par l’augmentation de la force ionique. Cette agrégation induit donc une diminution de la surface disponible pour le greffage, et donc une diminution de la densité de greffage.

L’effet du sel sur la densité de greffage de la protéine sur les nanoparticules d’Al est par contre inattendu : une forte diminution de la densité est observée lorsque la concentration saline passe de 0 à 15 mM passant de 600 à 100 protéines par nanoparticule. Cependant, lorsque la concentration en sel augmente, la densité augmente, passant de 100 à 435 protéines par nanoparticule de 15 à 140 mM. Cependant, ce taux de greffage reste inférieur à celui obtenu lorsqu’il n’y a pas d’ajout de sel, pour les mêmes raisons que celles données pour le CuO.

Ces résultats nous permettent de conclure que le taux de greffage est maximisé dans une solution de PB 10 mM sans ajout de charge ionique comme NaCl, pour les deux types de nanoparticules.

4.5.3. Effet de la sonication

Enfin, nous avons étudié l’effet de la sonication sur la densité de greffage de la Streptavidine sur les nanoparticules d’Al et de CuO, en appliquant une certaine durée de sonication après ajout de la Streptavidine à la solution colloïdale (0 sec, 30 sec, et 5 min). Les résultats sont donnés en Figure 87.

510 501 519 271 596 96,4 155 435 0 15 70 140 0 200 400 600 800 1000 [NaCl] (mM) No m b re d e S tr ep . p ar NP (# .NP -1 ) CuO Al

Figure 87: Nombre de Streptavidine greffées sur les nanoparticules d’Al et de CuO dispersées dans du PB 10 mM et Tween 0,05 % en fonction de la durée de sonication après ajout de la Streptavidine, après 8 h d’incubation. Les barres d’erreurs sont calculées par propagation des incertitudes.

Pour les nanoparticules de CuO, le nombre de protéines augmente de 510 à 855 après 5 min de sonication. Pour les nanoparticules d’Al, on observe une augmentation du nombre de Streptavidine par nanoparticule de 600 à 825 après 5 min de sonication. Ces résultats sont cohérents avec les résultats déjà publiées dans le cas de l’ADN greffé sur nanoparticules d’or (Hurst et al., 2006).

Nous pouvons conclure que les conditions qui permettent un taux de recouvrement maximal sont l’incubation de la Streptavidine dans une solution colloïdale de nanoparticules d’Al ou de CuO dans du PB 10 mM et du Tween concentrés à 10 mM et 0,05 % respectivement, après 5 min de sonication. Ces

paramètres sont donc appliqués par la suite dans la préparation des solutions colloïdales

CuO-Strep et CuO-ADN. Notons que la durée d’incubation de la Streptavidine sera

maintenue à 24 h lors de la fonctionnalisation d’un volume important de solution colloïdale (supérieure à 10 mL), l’effet du volume n’ayant pas été étudié.