CHAPITRE 3. MÉTHODOLOGIE
3.4 Quantification des génomes viraux dans les échantillons d’air
3.4.1 Extraction de l’ARN viral
L’extraction de l'ARN a été réalisée sur deux dilutions de chacun des échantillons d'air contenant les virus influenza. En raison de leur forte concentration, les échantillons provenant du contenu du nébuliseur et des tests d’inoculations avant et après les expériences ont été dilués à 10-2 et 10-3. Ceux des échantillons d'air, qui étaient faiblement concentrés, ont été utilisés sans dilution ou à une dilution de 10-1. Toutes les dilutions ont été effectuées dans le tampon phosphate de potassium. L'ARN a été extrait avec une trousse commerciale (QIAamp Viral RNA, Qiagen, Chatsworth, Californie, États-Unis), en suivant les instructions du fabricant. Cependant, une modification a été apportée à ce protocole. Le volume de 140 ul de chaque échantillon qui a été passé sur une colonne et l'ARN purifié a par la suite été élue dans un volume de 2 x 40 ml de tampon AVE fourni avec le kit, afin d’obtenir une élution plus efficace que si elle avait été réalisée avec un seul volume de 80 µl (44, 143). La suspension d'ARN ont été conservés à -86°C.
3.4.2 Transcription de l’ARN en ADNc
L'ARN du virus a par la suite été transformé en acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) en utilisant le kit iScript cDNA synthesis Kit (BioRad Life Sciences, Mississauga, Ontario, Canada). Pour ce, l’ARN extrait des échatillons a d’abord été chauffé à 96°C pendant 5 minutes puis mis sur glace pendant 5 autres minutes, afin de dénaturer les brins d’ARN. Ensuite, 5 µl de chaque échantillon ont été mélangés à 12,5 µl du iScript super mix, à 1 µl d’enzyme RT et à 10 µl d’H2O certifiée sans RNAse fournis avec le kit. La RT a par la suite été performée. Elle a débuté par une incubation de 5 minutes à 25°C,
41
puis s’est poursuivie par une incubation à 45°C pendant 30 minutes et par une incubation à 85°C pendant 5 minutes. Les échantillons ont été conservés à -20°C jusqu’à la qPCR..
3.4.3 Réaction en chaîne par polymérase quantitative 3.4.3.1 Mise au point des qPCR et choix des amorces
Les qPCR pour la souche de virus influenza A H1N1 pr/8/1934 et chacune des souches d’influenza contenues dans le vaccin Flumist® ont été mises au point au laboratoire.
Pour ce, sur les conseils du Dre Nathalie Turgeon, les amorces et les sondes doublement marquées recommandées par l’OMS pour le qPCR universel sur l’influenza A ont été choisies (27). Pour la souche d’influenza B contenue dans le vaccin, la méthode tirée de Selvaraju et ses collègues a été choisie (120). Les amorces 5'-GAC ARC TCC TGT CAC CTC TGA C-3 'et 5'-AGG GCA ATS TGG ACA AAK CGT CTA-3' de même que la sonde 5'-/ FAM / TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG / 3IABlk_FQ-3' provenant de la compagnie Integrated DNA Technology (Coralville, Iowa, États-Unis) ont été utilisées pour les souches de grippe A. Pour la souche d’influenza B contenue dans le vaccin, les amorces 5'-TCC TCA ACT CAC TCT TCG AGC G-3 ' et 5'-CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG- 3' ainsi que la sonde 5-'/ 56-FAM / CC AAT TCG A / ZEN / G CAG CTG CTG AAA CGG TG / 3IABkFQ /-3' de la même compagnie ont été utilisés. Les amorces 5'-3' et les sondes ont été marquées à la fluorescéine (FAM) à leur extrémité 5' et Iowa Noir FQ (IABlkFQ) à leur extrémité 3'. La sonde de la grippe B utilisée possédait également un extincteur (ZEN) au milieu de sa séquence.
3.4.3.2 Préparation de l’ADN plasmidique pour les courbes standard
Pour la courbe standard, de l’ADN transcrit a été fabriqué in vitro d’après la méthode décrite par Sambrook et ses collègues (116). Pour ce, le TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Butlington, Ontario, Canada) a été utilisé en suivant les instructions du manufacturier. Brièvement, les virus grippaux A et B ont d'abord eu la zone d'intérêt de leur génome amplifiée par PCR en utilisant les amorces appropriées mentionnées précédemment. Les fragments obtenus suite à l'amplification ont été clonés dans le vecteur de clonage pDRIVE
de Qiagen fourni avec le kit et transformés dans des cellules compétentes MC1061 de la bactérie Escherischia coli, d’après la méthode du chlorure de rubidium d’Utermohlen et ses collègues (147). Les plasmides obtenus ont été purifiés à partir des bactéries en utilisant cette fois la trousse Mini Kit Plasmid (Qiagen, Chatsworth, Californie, États-Unis). Ils ont été quantifiés avec un spectrophotomètre GeneQuant Pro UV/Vis (Biochrom Ltd., Cambridge, Royaume-Uni). La taille de même que la nature de l'ADNc de l’influenza A et B ont été vérifiées par migration sur gel d’agarose 1,5% de même que par séquençage et comparaison avec les séquences correspondantes dans la GenBank (96). Le matériel génétique pour les courbes standard a été conservé à -20°C jusqu'à la qPCR. Les plasmides pour la courbe standard de la grippe A ont été préparés par la Dre Nathalie Turgeon (145).
3.4.3.3 Quantification des génomes par qPCR
Pour les qPCR, une courbe standard a été faite en triplicata à l'aide de l’ADN plasmidique cloné à partir des virus influenza A ou B. Des dilutions en série de facteur dix, allant de 100 à 108 molécules par réaction, ont été utilisés pour établir la courbe standard. Pour déterminer la concentration de génomes provenant des échantillons de virus, les deux dilutions de l'ADNc réalisées pour chacun d’entre eux ont été quantifiés en trois exemplaires, pour être sûr qu'ils étaient dans la gamme de la courbe standard et analysés. Un contrôle négatif qui contenait tous les réactions à l’exception d’ADN a également été fait en trois exemplaires. Le mélange réactionnel d’un volume de 25 µl total par puit était constitué de 2 µl du gabarit d’ADN, de 20 pmol de chaque amorce pour l’influenza A et de 25 pmol de chaque amorce pour l’influenza B, de 5 pmol de la sonde doublement marquée correspondant au type de virus à identifier et de 12,5 µl du tampon 2X du iScript Supermix (BioRad Life Sciences, Mississauga, Ontario, Canada). Le programme du qPCR a débuté par 2 minutes d’incubation à 95°C pour permettre la dénaturation de l’ADN et l’activation de la polymérase. Puis, il s’est poursuivi par 45 cycles d’amplification incluant une dénaturation à 95°C pendant 15 secondes, un appariement et une élongation à 55°C pendant 30 secondes ainsi qu’une lecture de la fluorescence suivant l’étape d’élongation. Toutes les qPCR ont été réalisées à l’aide de l’appareil Opticon 2 (MJ Research, Waltham, Massachusetts, États- Unis).
43 3.4.3.4 Analyse des données avec le logiciel
Les données ont été analysées avec le logiciel Monitor Version Opticon 2.02.24 fourni avec l'appareil. Le bruit de fond a d’abord été soustrait de toutes les valeurs enregistrées à l'aide de la fonction du logiciel « average over cycle range ». Le seuil de détection a de même été ajusté manuellement grâce à la fonction « manual treshold ». La courbe standard de la qPCR a permis de déterminer les concentrations inconnues de virus. Le tracé des valeurs de seuil (Ct) des différentes dilutions de la courbe d'étalonnage en fonction du logarithme de la concentration d’ADN donne une ligne droite. La pente de la droite de ce graphique, dont l’équation est E = (10-1/slope-1) x 100, fournit des renseignements sur l’efficacité de la qPCR. Comme dans une étude précédente de notre équipe, les résultats obtenus ont été jugées adéquats lorsque la pente était supérieure à 0,27, ce qui correspond à un E minimal de 85%. De plus, le coefficient de détermination de la droite (R2) devait être supérieur à 0,9, démontrant ainsi un faible écart entre les points et la droite (143). La limite de détection de l’influenza A H1N1, soit la plus petite concentration provenant d’un échantillon de départ et pouvant être détectée dans les trois puits lors d’une RT suivie d’une qPCR, a été évaluée à 1x106 EID50/ml par la Dre Nathalie Turgeon (expériences et résultats non montrés) (144).