CHAPITRE 3. MÉTHODOLOGIE
3.3 Expériences d’aérosolisation et d’échantillonnage
3.3.2 Nébulisation et échantillonnage dans la chambre d’aérosolisation SCL-GenaMin
La SCL-GenaMini (SCL Medtech Inc., Montréal, Québec, Canada) (Figure 8), une chambre dynamique à faible débit et permettant de travailler en niveau de confinement 2, puisque située sous une enceinte biologie, a été utilisée dans ce projet. Cela a été réalisé tel que d’écrit précédemment dans d’autres études, où elle avait été employée avec succès pour l’aérosolisation de quelques microorganismes (44, 53, 156). Un atomiseur de TSI (modèle 9302, TSI Inc., Shoreview, Minnesota, États-Unis) (Figure 9A et Figure 9B) a été utilisé pour générer des aérosols avec de l’air médical comprimé. La pression de l’air entrant dans le nébuliseur permet d’impacter un jet de liquide et de gaz sur la paroi interne d’un récipient à
un faible niveau de dispersion de 3 L/min et les goutellettes de liquide qui n’ont pas été aérosolisées retournent dans la suspension située dans le récipient. Le nébuliseur contenait soit 7 µl du traceur fluorescent Alexa à 10 µM avec 1 ml de la neuraminidase purifiée de Clostridium perfringens solubilisée à 250 µg/ml, ou 1 ml de liquide allantoïque contenant le virus influenza A H1N1 préalablement cultivé. Celui-ci, dont le titre infectieux était de 1x1010 EID50/ml, a été filtré sur une membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) de 33 mm de diamètre et d’une porosité de 0,45 µm (SLHV033L5, Millipore, Billerica, Massachusetts, États-Unis), immédiatement avant d’être ajouté au contenu du nébuliseur pour l’aérosolisation. Cette procédure avait pour but d’enlever les gros débris de cellules provenant de la culture dans les œufs embryonnés. Le volume total de 70 ml que doit contenir l’atomiseur de TSI lors d’une expérience a été complété avec du tampon phosphate de potassium, tout juste avant de débuter l’aérosolisation.
Après leur production, les aérosols ont circulé dans un tube (Diffusion dryer modèle 3062, TSI Inc., Shoreview, Minnesota, États-Unis) rempli de billes de dessicant (EM- DX0017-3EMD, Chemicals Inc., Gibbstown, New Jersey, États-Unis) pour enlever l’eau qu’ils contenaient et ainsi former des noyaux de goutelettes (Figure 4A et Figure 8). Puis, ils sont entrés dans la chambre SCL-GenaMini. Dans celle-ci, de l’air médical comprimé a été mélangé aux aérosols à un débit de 30 L/min, afin de les diluer pour avoir un volume d’air dans la chambre suffisamment grand pour permettre de les échantillonner subséquemment. Les débits de nébulisation et de dilution ont été maintenus constants tout au long de l’échantillonnage, qui a été effectué simultanément avec la nébulisation. Un capteur de température et de d’humidité relative KIMO KH-210 datalogger (Chevrier instrument, Montréal, Québec, Canada) a permis de mesurer ces paramètres et de voir leur évolution dans la chambre pendant chaque essai. Les expériences ont été effectuées sous une température variant entre 18,6°C et 28,7°C et une humidité relative située entre 3,0% et 8,9%. De plus, le compteur optique de particules APS a permis de mesurer le diamètre aérodynamique des particules, ainsi que leur concentration dans l’air pendant toute la durée des expériences. Le diamètre aérodynamique est une façon d’exprimer la grosseur d’une particule aérienne de forme irrégulière. Plus spécifiquement, il correspond au diamètre d’une sphère homogène qui aurait la densité de l’eau, soit 1 g/cm3, et la même vitesse de déposition que la particule
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irrégulière (40). L’APS était connecté à la chambre à la suite de l’Aerosol Diluter (modèle 3302A, TSI Inc., Minneapolis, Minnesota, États-Unis), un appareil permettant de diluer les bioaérosols avant leur pénétration dans le compteur optique. En effet, la concentration de particules produites par le nébuliseur était trop concentrée pour être lue correctement par l’APS. Les données ont été enregistrées avec le logiciel fourni avec l’APS, soit l’Aerosol Instrument Manager. La concentration des aérosols et la distribution de leur diamètre aérodynamique variaient respectivement de 0,696 µm à 0,859 µm et de 1,82x103 particules/cm3 de 5,99x103 particules/cm3. Avant de commencer à échantillonner, la taille aérodynamique des aérosols générés et leur concentration ont été observées, afin de s'assurer qu’elles étaient constantes d’une nébulisation à l’autre.
#1 - Boutons de contrôle des débits de génération et de dilution de l’air circulant dans la chambre
#2 - Atomiseur de TSI
#3 - Tube rempli de billes de dessicant #4 - Chambre SCL-GenaMini
#5 - Ports d’échantillonnage où sont installés les échantillonneurs d’air, l’APS relié à l’Aerosol Diluter de même que les capteurs de température et d’humidité relative #6 - Entrée d’air médical comprimé
Figure 8 : Schéma de la chambre d’aérosolisation GenaMini et identification de ses différentes composantes.
Les aérosols sont générés par l’atomiseur de TSI, passent dans une tube de dessicant où ils forment des noyaux de gouttelettes, puis pénètrent dans la chambre d’où ils sont dilués, avant d’être échantillonnés par les différents ports autour de celle-ci. L’APS connecté à l’Aerosol Diluter permet de mesurer la concentration et le diamètre aérodynamique des particules. Des capteurs de température et d’humidité relative permettent de monitorer les conditions environnementales présentes dans la chambre pendant les expériences (figure tirée de l’article de Verreault et ses collègues) (156).
Figure 9 : L’atomiseur de TSI.
Grâce à la pression de l’air entrant dans ce nébuliseur (A), un jet de liquide et de gaz est envoyé à 3 L/min sur une sphère en plastique (B) sur laquelle il est dispersé, ce qui crée des aérosols. Les petites particules demeurent en suspension dans l’air tandis que les grosses gouttelettes retournent dans la solution se trouvant au fond du récipient.
3.3.2.2 Échantillonnage des aérosols avec le SKC Biosampler®
Le premier échantillonneur utilisé pour capturer les aérosols dans la chambre SCL- GenaMini était le SKC Biosampler® (SKC Inc., Eighty Four, Pennsylvanie, États-Unis) (Figure 10A), un échantillonneur qui procède par impaction inertielle en créant un vortex dans un liquide de collecte (57, 141, 153) (Figure 10B). Le liquide utilisé était le tampon
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phosphate de potassium, soit le même tampon que celui utilisé pour l’essai enzymatique. Cet échantillonneur d’air à faible débit était connecté à une pompe Gilair Aircon II (Levitt Sécurité, Montréal, Québec, Canada) et fonctionnait à 12,5 L/min, un débit d’air ajusté automatiquement grâce à son orifice critique. Il a été choisi parce que son processus de collecte des aérosols dans un liquide est connu comme étant moins dommageable pour de nombreux microorganismes, comparativement aux échantillonneurs à sec (16, 40, 50, 64, 91, 153). Il a servi à échantillonner les particules pendant des durées de 20 minutes, permettant ainsi de collecter les aérosols contenus dans un volume de 250 L d’air. Il n’était pas possible d’échantillonner davantage avec cet échantillonneur, puisque le liquide à l’intérieur s'évaporait et qu’un trop faible volume aurait empêché la formation du vortex et conséquemment la collecte des aérosols. Après chaque échantillonnage, le liquide restant dans l’appareil était récolté et mesuré pour tenir compte de son évaporation pendant l’expérience et par la suite collecté.
#1 - Section reliée à une pompe (sortie d’air)
#2 - Section reliée au port d’échantillonnage de la chambre (entrée d’air)
#3 - Vortex se formant à l’arrivée de l’air dans le liquide de collection situé au fond du récipient
Figure 10 : L’échantillonneur SKC BiosamplerÒ et les cassettes de 37 mm avec filtres en polycarbonate de porosité 0,8 µm.
Le SKC Biosampler® (A et B) récolte les particules par impaction intertielle dans un liquide et les cassettes de 37 mm contenant des filtres en polycarbonate de porosité 0,8 µm (C) procèdent par tamisage, par impaction inertielle, par diffusion des forces électrostatiques et par interception sur une surface solide (figure B tirée de Verreault et ses collègues) (155).
3.3.2.3 Échantillonnage des aérosols avec des cassettes contenant des filtres en polycarbonate de porosité 0,8 µm
Des cassettes sont le second type d’échantillonneur utilisé avec la chambre SCL- GenaMini pour collecter les échantillons d’air (Figure 10C). Elles sont constitués d’une membrane poreuse de 0,8 µm faite de polycarbonate (225-1602, SKC Inc., Eighty Four, Pennsylvanie, États-Unis) déposée sur une membrane de suport en nitrocellulose (225-2700, SKC Inc.), le tout hébergé dans une cassette de 37 mm (225-3050LF, SKC Inc.). Une fois montées, une bande de nitrocellulose (225-2509, SKC Inc.) a été mise autour de chaque cassette, afin de s’assurer que les différentes sections qu’elle comporte demeurent bien en place. Celles-ci permettent de collecter les particules aérosolisées grâce à divers mécanismes physiques tels que le tamisage, l’impaction inertielle, la diffusion des forces électrostatiques et l’interception. Ces échantillonneurs à sec ont prouvé leur efficacité dans différentes études (43, 153, 155). Dans les expériences de ce projet, les filtres ont été utilisés à un débit de 10,0 L/min contrôlé par des pompes Gilair Aircon II. Pour avoir le débit exact souhaité, les pompes ont préalablement été calibrées, tout juste avant le début de chaque expérience avec le Dry-Cal DC 2 Flow Meter (Brandt Instruments Inc., Prairieville, Louisiane, États-Unis) connecté à une cassette. Les cassettes ont été utilisées pour échantillonner les modèles d’enzyme pendant des périodes de 25, 50, 100 et 200 minutes. Dans le cas des expériences réalisées avec le traceur Alexa fluor 555 pour comparer l’efficacité de capture des filtres avec celle du SKC Biosampler® pour un même volume de 250 L d’air échantillonnés, elles ont seulement été réalisées pendant une période de 25 minutes. Suite à l’échantillonnage, les filtres ont été élués directement dans les cassettes. Pour ce, 2 ml du tampon qui était utilisé pour l’essai neuraminidase, soit le tampon phosphate de potassium, a été ajouté dans les cassettes. Les échantillons ont été agités avec un multi-vortex (Glas-Col, Terre Haute,
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Indianapolis, États-Unis) pendant 15 minutes à une vitesse du moteur de 70% et une fréquence de 100%, pour permettre une bonne resuspension des aérosols dans le tampon en vue de leur analyse. Cette méthode de resuspension des aérosols avait été démontrée comme étant plus efficace que la simple collectes des particules se trouvant sur le filtre, permettrant ainsi de récolter deux fois plus de particules (44). En effet, lorsque la cassette est ouverte et que le filtre est élué séparément, des aérosols sont perdus sur les parois tandis que presque tout est récupéré et que les pertes sont minimes lorsque l’élution se fait directement à l’intérieur.
Puisqu’il était impossible d’effectuer tous les échantillonnages au même moment étant donné que trop d’échantillonneurs étaient requis comparativement à la capacité de volume d’air que pouvait contenir la chambre SCL-GenaMini, qui ne permettait que d’en accueillir trois à la fois, et que le temps de collecte était différent pour chacun des échantillonneurs, ils ont été utilisés de manière randomisée afin de s’assurer que l’ordre de collecte n’avait pas d’effet sur les résultats obtenus. Chaque condition d’échantillonnage a été testée au moins trois fois pour les différents contenus du nébuliseur, soit l’Alexa fluor 555 et la neuraminidase purifiée, ainsi que le virus influenza A H1N1.
3.3.3 Nébulisation et échantillonnage dans la chambre d’aérosolisation wind tunnel