Chapitre 3 : Matériel et méthodes
3.4 Préparation des échantillons pour analyse CG-C-SMRI
3.4.2 Purification des métabolites de la phase sulfoconjuguée
Comme mentionné précédemment, une méthode de purification par CLHP-2D a dû être développée pour deux raisons précises. Premièrement, la concentration de DHEA sulfoconjuguée est beaucoup plus élevée que celle de la testostérone et il n’est pas possible d’avoir un temps suffisant entre les deux pics avec la méthode décrite précédemment pour les collecter sans fractionner un ou l’autre des stéroïdes. Deuxièmement, l’épiandrostérone majoritairement excrétée sous forme sulfoconjuguée se retrouve en grande concentration et élue dans la même fraction que l’épitestostérone, le 5α-adiol et le 5β-adiol, présents en faibles concentrations. De plus, lors de l’analyse CG-C-SRMI, l’épiandrostérone coélue avec les 5α- adiol et 5β-adiol, ce qui rend la mesure inexacte.
La totalité du volume de l’échantillon, soit 20 µL, est injecté sur l’appareil CLHP (1100 HPLC- UV, Agilent Technologies) muni de deux pompes quaternaires reliées à deux valves
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indépendantes à six ports. La première séparation est effectuée avec une colonne Agilent Eclipse XDB-Phenyl (4.6 mm × 250 mm avec des particules de 5 µm) dans un four à température constante à 40 °C. Les conditions initiales sont un débit de 0.80 mL/min et une composition de la phase mobile à 70 % d’eau et 30 % d’acétonitrile. La composition de la phase mobile en acétonitrile augmente graduellement jusqu’à 35 % après 15.0 min, à 50 % après 20.0 min, puis à 55 % après 25.0 min et elle est maintenue à ce palier jusqu’à 30.0 min. À partir de 30.5 min, la phase mobile est changée à 50 % d’acétonitrile et 50 % de méthanol et ce mélange circule jusqu’à 55.0 min. À 56.0 min, la composition de la phase mobile est revenue aux conditions initiales et elle est maintenue ainsi jusqu’à 65.0 minutes. Le débit reste constant tout au long de la chromatographie. La deuxième séparation est effectuée sur deux colonnes Waters SunFire C18 (4.6 mm × 250 mm avec des particules de 5 µm) dans un four de température constante à 40 °C. Les conditions initiales sont un débit de 0.80 mL/min et une composition de la phase mobile à 60 % d’eau, 35 % d’acétonitrile et 5 % de méthanol. Ces conditions restent constantes pendant 26.0 min puis la phase mobile est modifiée graduellement pour atteindre 40 % d’eau, 55 % d’acétonitrile et 5 % de méthanol, et le débit augmente à 1.00 mL/min, à 50.0 min. Ces conditions restent constantes jusqu’à 57.0 min. À 57.1 min, la composition de la phase mobile devient 50 % d’acétonitrile et 50 % de méthanol et elle est maintenue jusqu’à 60.0 min. Ensuite, tout en gardant la même composition de la phase mobile le débit est augmenté graduellement jusqu’à atteindre 1.30 mL/min. À 60.5 min, le débit est constant à 1.30 mL/min mais la composition de la phase mobile est maintenant de 65 % d’eau, 30 % d’acétonitrile et 5 % de méthanol. Finalement, à 62.0 min, le débit revient à sa valeur initiale de 0.80 mL/min. Ces conditions sont conservées jusqu’à la fin de la séparation chromatographique à 65.0 min. Comme décrit par Ouellet et al. (2013), afin d’effectuer la séparation par la deuxième dimension chromatographique, il est nécessaire de changer la position des valves à six ports pendant les bons intervalles de temps, lesquels sont ajustés selon les temps de rétention des stéroïdes d’intérêt. Un schéma représentant le montage de la chromatographie à deux dimensions ainsi que les positions des valves à six ports est montré à la Figure 3.2. Les valves 1 et 2 prennent simultanément la position 2 de 19.8 min à 21.1 min pour ensuite revenir en position 1, puis changent de nouveau en position 2 de 22.8 min à 26.0 min pour ensuite revenir en position 1. Ces deux changements permettent l’envoi des métabolites sélectionnés sur les deux colonnes pour la seconde séparation. Par la suite, de 38.0 min à 65.0 min, seule la valve 1 prend la position 2, alors que la valve 2 reste en position 1. Ce positionnement permet aux stéroïdes purifiés d’être envoyés au collecteur de fractions plutôt qu’à la récupération des solvants. Une solution contenant les stéroïdes standards de testostérone, DHEA, 5β-adiol, 5α-adiol,
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épitestostérone, prégnandiol, épiandrostérone, étiocholanolone, androstérone, 16-enol et androstènediol est injectée avant chaque lot d’échantillons afin de s’assurer du bon fonctionnement de la chromatographie et pour ajuster les temps de changements de position des valves. Les stéroïdes sont recueillis en sept fractions distinctes. Même dans ces conditions, la séparation complète de l’épiandrostérone des 5α-adiol et 5β-adiol n’a pas été obtenue. Ces stéroïdes sont donc collectés dans une même fraction, la septième (F7), avant d’être séparés à nouveau par une autre méthode de purification en CLHP-2D.
Après évaporation à sec sous jet d’azote à 50 °C, le contenu de cette fraction est transféré dans un vial contenant un insert de 250 µL comme décrit précédemment. La fraction est injectée sur l’appareil CLHP (UFLC Prominence XR, Shimadzu) muni de deux pompes quaternaires, d’une colonne Agilent Eclipse XDB-C8 (4.6 mm × 150 mm avec des particules de 5 µm) pour la première dimension et de deux colonnes Agilent Zorbax SB-C18 (4.6 mm × 250 mm avec des particules de 5 µm) pour la deuxième dimension, placées dans un four avec une température constante à 40 °C. Les conditions initiales de la chromatographie pour la première séparation sont un débit de 0.60 mL/min et une composition de la phase mobile à 64 % d’eau, 30 % d’acétonitrile et 6 % de méthanol. Ces conditions sont maintenues pendant 20.0 min puis le débit et la composition en acétonitrile augmentent graduellement pour atteindre à 30.0 min 0.70 mL/min et 45 % respectivement. À 35.0 min, la composition en acétonitrile atteint 55 % et le débit est de 0.80 mL/min. Puis, les conditions reviennent à leur valeur initiale à 35.5 min jusqu’à la fin de la séparation à 70.0 min. La composition de la phase mobile en méthanol reste constante tout au long de la chromatographie. Pour la deuxième séparation, les conditions initiales sont un débit de 0.60 mL/min ainsi qu’une composition de la phase mobile de 49 % d’eau et 51 % d’acétonitrile. Ces conditions restent constantes pendant 33.0 min, puis la composition en acétonitrile augmente graduellement à 61 % à 53.0 min, puis à 71.5 % à 67.0 min, avant de revenir aux conditions initiales à 68.0 min jusqu’à la fin de la chromatographie à 70.0 min. Le transfert des stéroïdes pour la deuxième séparation est effectué entre 30.4 et 32.0 min, l’intervalle pendant lequel les deux valves sont placées en position 2. À 39.0 min, la valve 1 est placée en position 2 et la valve 2 en position 1, afin de collecter les stéroïdes éluant de la deuxième séparation. Les stéroïdes sont recueillis en trois fractions distinctes. Le logiciel d’acquisition de données du CLHP-2D utilisé est Analyst 1.6 Software Build 3773. Cette méthode a permis la séparation des métabolites sulfoconjugués pour les études SA44 à SA53.
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Figure 3.2 : Montage du CLHP-2D pour la purification des stéroïdes avec différentes positions des valves à six ports
où A) les deux valves sont en position 1 pour éluer les stéroïdes sur la première dimension, B) les deux valves sont en position 2 pour transférer les stéroïdes d’intérêt sur la deuxième dimension et C) la valve 1 est en position 2 et la
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Figure 3.3 : Chromatogramme UV à 192 nm de la purification CLHP-2D d’un mélange de stéroïdes standards. Pics
1 : Et, 2 : A, 3 : pgdiol, 4 : 16-enol, 5 : 5Aen, 6 : T, 7 : DHEA, 8 : 4Aen, 9 : E, 10 : 5β-adiol, 11 : EpiA, 12 : 5α-adiol, 13 : pgtriol. F1 à F7 représentent les sept fractions collectées.
Pour la deuxième séparation, les conditions initiales sont un débit de 0.60 mL/min ainsi qu’une composition de la phase mobile de 49 % d’eau et 51 % d’acétonitrile. Ces conditions restent constantes pendant 33.0 min, puis la composition en acétonitrile augmente graduellement à 61 % à 53.0 min, puis à 71.5 % à 67.0 min, avant de revenir aux conditions initiales à 68.0 min jusqu’à la fin de la chromatographie à 70.0 min. Le transfert des stéroïdes pour la deuxième séparation est effectué entre 30.4 et 32.0 min, l’intervalle pendant lequel les deux valves sont placées en position 2. À 39.0 min, la valve 1 est placée en position 2 et la valve 2 en position 1, afin de collecter les stéroïdes éluant de la deuxième séparation. Les stéroïdes sont recueillis en trois fractions distinctes. Le logiciel d’acquisition de données du CLHP-2D utilisé est Analyst 1.6 Software Build 3773. Cette méthode a permis la séparation des métabolites sulfoconjugués pour les études SA44 à SA53.
Une autre méthode a dû être développée sur l’appareil CLHP en utilisant une nouvelle colonne Agilent Eclipse XDB-C8, possédant vraisemblablement des propriétés différentes de la colonne précédente. Des hypothèses concernant ces différences sont présentées au Chapitre 4. Cette nouvelle méthode a été utilisée afin de séparer les métabolites sulfoconjugués des études SA57, SA58 et SA60 en plus des échantillons urinaires d’ahtlètes pour l’analyse de la hCG et de la testostérone. Les conditions initiales de la méthode sont un débit de 0.70 mL/min et une composition de la phase mobile de 64 % d’eau, 30 % d’acétonitrile et 6 % de méthanol. Les conditions initiales sont constantes pendant 10.0 min, puis la composition en acétonitrile augmente graduellement pour atteindre 45 % à 40.0 min, pour ensuite revenir à 30 % à 40.5
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min et ce, jusqu’à la fin de la séparation à 46.0 min. La température du four est maintenue à 40 °C, tandis que le débit et la composition en méthanol sont constants tout au long de la chromatographie. Les stéroïdes sont recueillis en trois fractions. Ainsi tous les stéroïdes ont été séparés à l’exception de l’épitestostérone et de l’épiandrostérone. Ces deux stéroïdes ne coéluent pas lors de l’analyse CG-C-SMRI. Cependant, comme leur concentration respective est très différente, la signature isotopique de l’épitestostérone n’a pu être établie dans tous les échantillons puisque l’intensité de son pic chromatographique était souvent sous la limite de linéarité lorsque celle de l’épiandrostérone était dans un intervalle acceptable. Un chromatogramme de la séparation des stéroïdes standards est présenté à la Figure 3.4.
Figure 3.4 : Chromatogramme UV à 192 nm de la purification CLHP des stéroïdes standards contenus dans la
fraction F7 collectée lors de la purification CLHP-2D. Pics 1 : 4Aen, 2 : E, 3 : EpiA, 4 : 5β-adiol et 5α-adiol. F8 à F10 représentent les trois fractions collectées.
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Les fractions récupérées sont évaporées sous un jet d’azote à 50 °C puis, en fonction des concentrations mesurées par CG-SM/SM, les fractions sont transférées en partie ou en totalité dans des vials contenants des intérieurs coniques de 400 µL afin que les volumes d’injection permettent d’obtenir une réponse contenue dans la gamme de linéarité de l’appareil. De plus, certaines fractions sont mélangées lorsque les métabolites qu’elles contiennent ne coéluent pas lors de l’analyse par CG-C-SMRI et que leurs concentrations sont similaires, afin de réduire le nombre d’injections. C’est le cas des fractions 2 et 4, ainsi que des fractions 3 et 5 pour les stéroïdes glucuroconjugués. Dans le cas des stéroïdes sulfoconjugués, toutes les fractions sont injectées séparément. Un standard externe d’androstanol est ajouté à chaque échantillon comme référence de temps de rétention. Une fois les stéroïdes mélangés, transférés dans les vials et après l’ajout du standard externe, le méthanol est évaporé sous un jet d’azote à 50 °C, puis chaque échantillon est solubilisé dans un mélange d’acétate d’éthyle/hexane 20:80 v/v dans un volume idéal pour l’analyse par SMRI.