Chapitre 3 : Matériel et méthodes
3.5 Analyse par CG-C-SMRI
Les valeurs δ13C des analytes sont déterminées en comparaison de celle déterminée pour le
CO2 de référence. Comme décrit par Ouellet et al. (2013), celles-ci sont corrigées par une
courbe d’étalonnage établie à partir de standards de tous les analytes dont les valeurs isotopiques sont connues (Geotop, UQAM). Celles-ci varient de -17.0 à -33.5 o/
oo soit sur toute
la gamme des valeurs attendues, et ce tant pour les substances naturelles que synthétiques. L’injection d’une solution d’alcanes de valeurs connues (Indiana University) permet de vérifier la justesse de l’appareil en début d’analyse alors qu’un standard externe de trois stéroïdes USADA Cu-1 (T. Brenna, Cornell University) permet de démontrer l’exactitude des mesures effectuées à l’aide des courbes étalons. Une déviation de plus de 0.5 o/
oo entraîne l’entretien de l’instrument.
Le Tableau 3.3 présente la composition des deux solutions utilisées pour l’étalonnage ainsi que les valeurs δ13C déterminées par Geotop (UQAM). Ainsi, comme décrit par Ouellet et al. (2013),
avant chaque séquence d’analyses, la stabilité de l’appareil et l’efficacité de la colonne de combustion sont vérifiées par l’analyse d’alcanes de signatures isotopiques certifiées.
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Tableau 3.3 : Description de la composition des solutions d’étalonnage A et B, et de vérification des performances (USADA Cu-1) selon Ouellet et al. (2013).
Solution d’étalonnage Substances Valeurs δ13C certifiées (‰)1
Solution A Chol -25.14 ± 0.04 5α-adiol -30.88 ± 0.03 5β-adiol -29.02 ± 0.09 DHEA -33.49 ± 0.13 pgdiol -17.09 ± 0.26 T -27.77 ± 0.05 Solution B Androstanol -31.24 ± 0.05 16-enol -27.27 ± 0.02 A -20.88 ± 0.21 E -33.34 ± 0.09 Et -22.06 ± 0.16 pgdiol -18.60 ± 0.24
Solution USADA Cu-1
A -27.06
Et -28.90
pgdiol -31.48
1 Mesurées par un analyseur élémentaire Elementar couplé à un IRMS Isoprime (Geotop, UQAM). La signature
isotopique est obtenue vs. un standard de sucrose (-11.85 ‰) et de leucine (-28.75 ‰) calibré vs. VPDB et selon l’échelle NBS19-LSVEC. Le CO2 utilisé comme gaz de référence pour chaque analyse a été certifié vs. VPDB en
utilisant un système IRMS Isoprime muni de deux ports d’injection (Geotop, UQAM).
Les solutions A et B contenant les stéroïdes standards sont utilisées pour tracer une courbe des valeurs certifiées de δ13C en fonction des valeurs mesurées de δ13C, nécessaire à la correction
des valeurs isotopiques des échantillons. Ces solutions A et B, préparées à une concentration d’environ 50 ng/µL dans un mélange 20 : 80 v/v d’acétate d’éthyle/hexane, encadrent une séquence d’injections d’un maximum de 15 à 20 échantillons. La Figure 3.5 présente les chromatogrammes CG-C-SMRI des stéroïdes standards contenus dans les solutions A et B respectivement, alors que la Figure 3.6 montre une courbe d’étalonnage typique.
La régression linéaire obtenue de type y = mx + b est l’équation utilisée pour corriger les valeurs isotopiques des échantillons, où y représente la valeur isotopique corrigée du stéroïde, m représente la pente de la régression qui est égale à 1 lorsque les valeurs certifiées et mesurées des stéroïdes standards sont identiques, x représente la valeur isotopique mesurée du stéroïde et corrigée par le CO2 certifié, et b représente la déviation du ratio isotopique à l’ordonnée à
l’origine de la droite de régression. Finalement, dans chaque séquence d’analyse est ajouté un standard USADA Cu-1 à une concentration d’environ 16 ng/µL dans un mélange 20 : 80 v/v d’acétate d’éthyle/hexane. Cette solution permet de vérifier l’efficacité de la correction isotopique lorsque les valeurs mesurées et corrigées du ratio isotopique des stéroïdes ne dévient pas de plus ou moins 0.3 ‰ de leurs valeurs certifiées.
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Figure 3.5 : Chromatogramme de l’analyse par CG-C-SMRI de 7 stéroïdes standards contenus dans les solutions A
et B. Chromatogramme A, pics 1 : androstanol, 2 : 5β-adiol, 3 : DHEA, 4 : 5α-adiol, 5 : T, 6 : pgdiol, 7 : chol et chromatogramme B, pics 1 : 16-enol, 2 : androstanol, 3 : Et, 4 : A, 5 : E, 6 : pgdiol.
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Figure 3.6 : Courbe d’étalonnage typique utilisée lors des analyses par CG-C-SMRI à partir des solutions standards
A et B, produite à partir des valeurs certifiées en fonction des valeurs mesurées de δ13C (‰) des stéroïdes.
3.5.2 Méthode d’analyse CG-C-SMRI
Comme décrit par Ouellet et al. (2013), les échantillons et les différents standards sont analysés sur un appareil CG-C-SMRI (Agilent HP7890-Isoprime) muni d’une colonne chromatographique DB-5MS de Agilent (25 m × 200 µm × 0.33 µm) ainsi que d’un four à combustion composé d’une colonne en quartz d’un diamètre interne de 0.6 mm remplie de granules d’oxyde de cuivre (CuO). Les températures de l’injecteur, de la ligne de transfert et de la fournaise sont respectivement de 270 °C, 350 °C et 850 °C. L’injection utilise un volume compris entre 1 et 3 µL, selon la concentration des métabolites, sous un mode débit non partagé pulsé à 40 psi pendant 1 min. Cette séparation chromatographique est effectuée à l’aide d’un gaz vecteur d’hélium ayant un débit constant de 1.2 mL/min. La programmation de température du four débute à 80 °C pendant 1 min puis augmente à 250 °C, 275 °C et 320 °C avec une vitesse respective de 15 °C/min, 5 °C/min et 20 °C/min. La température est alors maintenue à 320 °C pendant 4.75 min. La durée totale de la séparation est de 24.6 min. Le CO2 produit par la
combustion des stéroïdes lors du passage au travers du four à combustion est séché à l’aide d’une membrane de Nafion avant d’être envoyé à l’analyseur et la source, ajustée à un courant de 400 nA. Le logiciel d’acquisition de données du CG-C-SMRI utilisé est IonVantage for Isoprime, alors que le logiciel de traitement de données utilisé est Continuous Flow Data Processing. La vérification de la composition des fractions analysées a été vérifiée lorsque nécessaire par l’analyse CG-SM (GC Systems 7890 couplé au MSD 5975, Agilent
-35,00 -30,00 -25,00 -20,00 -15,00 -35,00 -30,00 -25,00 -20,00 -15,00 V ale u rs ce rt if iée s δ 13C (‰ ) Valeurs mesurées δ13C (‰) Standard A Standard B y = 1.0266x + 0.1270 r2 = 0.9992
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Technologies). La colonne et la méthode de séparation sont les mêmes que pour l’analyse en CG-C-SMRI, conservant les temps de rétention typiques de chaque stéroïde. Le logiciel d’acquisition de données du CG-SM utilisé est MSD Chemstation E.02.00.493
3.5.3 Stabilité des mesures CG-C-SMRI
Les moyennes et les coefficients de variation des valeurs de ratios isotopiques du carbone des métabolites des urines contrôles négative et positive analysés en plusieurs lots sur une période d’un an sont présentés aux Tableaux 3.4, 3.5 et 3.6. À noter, la concentration des métabolites de la fraction sulfoconjuguée était trop faible dans le contrôle positif pour en permettre l’analyse. Les valeurs mesurées sont stables, autant pour les métabolites sulfoconjugués que glucuroconjugués, ne variant que de moins de -3.0 %. La moyenne des valeurs mesurées de l’androstanol, le standard externe, suite à 870 analyses est de -31.5 ‰, avec un coefficient de variation (CV) de -0.7 % et une valeur certifiée de -31.2 ‰, sur plus d’un an d’analyse et sur
deux appareils différents. Ces résultats démontrent aussi la stabilité des mesures entre chaque lot analysé dans le temps ainsi que la robustesse de cette méthode.
Tableau 3.4 : Stabilité des valeurs δ13C (‰) des métabolites hydrolysés (fraction des glucuroconjugués) de l’urine contrôle négative.
DHEA T 5α-adiol 5β-adiol E pgdiol 16-enol A Et
-18,7 -20,6 -20,6 -20,2 -20,9 -19,6 -19,8 -19,6 -20,3
σ -0,3 0,3 0,1 0,2 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1
CV (%) -1,5 -1,6 -0,4 -1,0 -1,3 -0,9 -1,0 -0,6 -0,5
Tableau 3.5 : Stabilité des valeurs δ13C (‰) des métabolites hydrolysés (fraction des sulfoconjugués) de l’urine contrôle négative.
EpiA 5Aen DHEA A Et
-19,8 -20,4 -18,1 -18,7 -19,8
σ 0,1 0,2 0,2 0,2 0,6
CV (%) -0,5 -0,8 -1,3 -1,1 -2,9
Tableau 3.6 : Stabilité des valeurs δ13C (‰) des métabolites hydrolysés (fraction des glucuroconjugués) de l’urine contrôle positive.
DHEA T 5α-adiol 5β-adiol E pgdiol 16-enol A Et
-20,2 -29,0 -28,8 -28,9 - -21,1 - -26,8 -27,8
σ 0,6 0,2 0,3 0,1 - 0,1 - 0,1 0,1
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