Durant les années 1980, plusieurs athlètes voulant se doper devinrent craintifs face à l’utilisation de stéroïdes synthétiques plus facilement détectables qu’auparavant et possédant plusieurs effets secondaires indésirables. On observa alors un retour des stéroïdes correspondant aux formes endogènes des molécules, c’est-à-dire potentiellement présents chez les humains comme la testostérone, afin d’obtenir l’effet anabolisant recherché (de Mondenard, 2000). Cette administration de stéroïdes est plus complexe à détecter, rien ne les distinguant de ceux normalement présents dans l’urine. Les grandes variations individuelles dans l’excrétion de la testostérone et de ses métabolites ne permettent pas l’établissement d’un seuil fiable et efficace. Au fil des années, le laxisme de certaines législations ainsi qu’un contrôle de qualité déficient de certaines industries ont facilité l’entrée sur le marché de suppléments nutrionnels contenant des stéroïdes androgènes anabolisants (SAA) endogènes, comme la testostérone et ses précurseurs, l’androstènedione, l’androstènediol et la DHEA (Ayotte et al., 2001, Van Thuyne et al., 2006). Bien que toujours difficile à confirmer, la présence de SAA synthétiques, établis par l’analyse CG-C-SMRI, compte pour 72 des 1192 cas positifs aux anabolisants, alors que la présence de testostérone compte pour 10 cas (Agence mondiale antidopage, 2015a). Cependant, il faut noter un total de 56 cas de rapports T/E élevés, soit supérieurs à 4, qui n’ont pu être confirmés et certainement un grand nombre de cas non détectés par les sondes plus ou moins efficaces utilisées. En 2009, l’Agence mondiale antidopage (AMA) rapportait que 64.9 % des tests antidopage atypiques et positifs étaient dus à ces SAA endogènes (Shelby et al., 2011), ce qui démontrait bien la nécessité d’en améliorer les analyses.
L’utilisation de ces stéroïdes entraîne des modifications du profil stéroïdien de l’individu, causant une augmentation de l’excrétion des métabolites produits par la chaîne de biotransformation du stéroïde, ainsi qu’une modification de la signature isotopique du carbone de ces métabolites (Agence mondiale antidopage, 2014b). Il est possible de détecter des variations anormales de certains ratios de concentration, comme le T/E dont la valeur la plus fréquente est approximativement autour de 1, mais qui peut varier considérablement selon les individus. Dans les années 1990, sur la base des distributions statistiques des valeurs chez les populations de référence, un rapport T/E supérieur à 6, puis 4, semblait suffisamment anormal pour nécessiter un suivi, consistant en la détermination des valeurs naturelles de l’athlète. L’application de la
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GC-C-SMRI permettant de distinguer les signatures isotopiques synthétiques ou naturelles des métabolites s’est ajoutée à la fin de cette décennie. De nos jours, la confirmation de l’origine exogène du stéroïde par l’analyse CG-C-SMRI est la méthode principalement utilisée pour confirmer les cas positifs (Ayotte, 2008, Van Renterghem et al., 2010a). Une valeur ∆δ13C de
plus de -3 ‰, obtenue par comparaison avec un stéroïde endogène de référence, est utilisée comme critère de confirmation pour déterminer hors de tout doute l’origine exogène du stéroïde (Ouellet et al., 2013, Piper et al., 2008). La sélection des échantillons suspects basée uniquement sur les distributions de populations entraîne un nombre important de faux négatifs. C’est pourquoi, depuis 2014, l’Agence mondiale antidopage a introduit les suivis longitudinaux des profils stéroïdiens des athlètes. Les analyses CG-C-SMRI sont maintenant effectuées suite à l’obtention de valeurs individuelles anormales.
Les analyses décrites ci-haut sont effectuées par CG-SM et utilisent seulement la fraction glucuronide des métabolites de phase II, puisque les méthodes d’extraction et d’hydrolyse enzymatique ont été démontrées spécifiques et quantitatives par l’utilisation de préparations de β-glucuronidase de E. coli (Ayotte et al., 1996, Hauser et al., 2008). Par contre, les stéroïdes hydroxylés en position C-3β, comme la DHEA, l’androstènediol et l’épiandrostérone, sont majoritairement excrétés comme sulfates (Chalbot et al., 2005, Schanzer, 1996). Malheureusement, cette fraction n’est pas analysée, puisque l’hydrolyse enzymatique de ces métabolites n’est pas spécifique et entraîne des réactions secondaires qui altèrent le profil stéroïdien. En effet, des extraits d’Helix pomatia contiennent de la β-glucuronidase ainsi que de l’arylsulfatase nécessaires à l’hydrolyse simultanée des métabolites glucuronides et sulfates. Cependant, plusieurs stéroïdes sulfoconjugués, dont notamment la testostérone et l’épitestostérone, résistent à l’hydrolyse par cette arylsulfatase. De plus, la présence dans ces extraits, qui sont principalement des sucs bruts, d’autres enzymes, comme la 3β- hydroxystéroïde oxydoréductase et la 3-oxostéroïde-4,5-ène isomérase, induit des réactions indésirables. Parmi celles-ci, la transformation de la DHEA en androstènedione, ainsi que la transformation de l’androstènediol en testostérone, ce qui rend cette méthode d’hydrolyse incompatible avec les analyses antidopage (Ayotte, 2010, Ferchaud et al., 2000, Gomes et al., 2009, Mareck et al., 2008).
L’hydrolyse chimique, ou solvolyse, est alors nécessaire pour l’analyse des sulfates. Depuis la fin des années 1950, l’acétate d’éthyle en milieu acide était généralement utilisé (Ayotte et al., 1996). Toutefois, Lévesque (1998) a perfectionné les conditions de réaction afin d’obtenir une spécificité et un rendement maximal, en minimisant les réactions secondaires indésirables, telle
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l’acétylation de certains stéroïdes en présence d’acétate d’éthyle. La méthode ainsi développée utilise plutôt du tétrahydrofurane (THF) comme solvant et de l’acide sulfurique (H2SO4 4 M)
comme catalyseur (50 °C, 60 min). La mise au point de cette méthode très efficace et fort simple d’hydrolyse des métabolites sulfoconjuqués a permis leur analyse et grandement facilité l’étude de leurs variations et leur pertinence comme sondes diagnostiques suite à l’administration de SAA.
En effet, l’analyse des sulfates permet la détection d’autres métabolites hydroxylés en C-3β, comme l’épiandrostérone, qui pourraient présenter un potentiel diagnostique encore inutilisé. Ainsi, il est intéressant d’évaluer les avantages et les inconvénients de l’analyse des métabolites sulfates par CG-SM/SM et CG-C-SMRI, afin d’obtenir les profils stéroïdiens et les signatures isotopiques des stéroïdes de cette fraction. Ces analyses permettront d’évaluer la pertinence d’analyser les sulfates lors des tests antidopage. Pour ce faire, des échantillons provenant de plusieurs sujets ont été analysés : six études suite à l’administration de doses uniques d’androstènedione, trois de DHEA, une d’androstènediol et trois de prégnénolone. En plus, des échantillons rendus positifs, possiblement plus représentatifs, ont été analysés et comparés : dix pour l’utilisation de testostérone, quatre pour l’utilisation de l’hormone chorionique gonadotrope (hCG) et un pour l’utilisation de DHEA. Finalement, l’analyse par CG-C-SMRI a requis le développement d’une méthode de séparation et de purification par CLHP-2D pour les métabolites de la fraction sulfate.
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