Chapitre 2 Méthodologie
2.2 Expression et purification du domaine Cache2 de Ca V a2d1
2.2.3 Purification de Cache2 en conditions dénaturantes
2.2.3.1 Chromatographie d’affinité pour ions métalliques immobilisés
(IMAC)
La totalité du surnageant est chargé sur une colonne d’affinité (HisTrap, GE
Healthcare) branché sur un système de chromatographie automatisé FPLC de type AKTA™
(Äkta pure, GE Healthcare). La colonne est composée d’une résine de nickel préalablement équilibrée avec le tampon A mentionné précédemment. L’échantillon est chargé sur une colonne ayant un volume de 5 ml, ce qui correspond à une capacité de liaison d’environ 40 mg de protéines ayant une étiquette histidine par ml de surnageant. L’évolution de la purification est suivie en temps réel en mesurant l’absorbance à 280 nm et visualisé sur un ordinateur relié à l’Äkta. Une fois la totalité de l’échantillon chargé sur la colonne, la résine est rincée avec le tampon A jusqu'à ce que l’absorbance retourne à la ligne basale, ce qui signifie que plus aucune protéine sort de la colonne. La protéine d’intérêt est ensuite éluée en utilisant une concentration croissante linéaire d’imidazole et collectée dans des tubes numérotés (Figure
20A). Le début du gradient permet, grâce à des faibles concentrations d’imidazole, d’éliminer
des protéines contaminantes ayant lié de façon non spécifique la colonne. Toutes les fractions récupérées aux différentes étapes du processus ont été analysées sur gel SDS-PAGE 12 % puis colorées au bleu de Coomassie (Figure 20B). Les fractions d’élution contenant la protéine Cache2 sont regroupées puis l’imidazole et le NaCl sont éliminés du tampon en utilisant des colonnes de dessalage (PD-desalting column, GE Healthcare).
Figure 20. Première étape de purification. A. Profil typique d’élution de Cache2 de la colonne d’affinité HisTrap. Le flow-through correspondant à la fraction protéique non
liée sur la colonne. Le gradient d’imidazole est indiqué par une rampe bleue. Le pic d’élution est indiqué par une flèche rouge. B. Les fractions de la protéine Cache2 sont analysées sur gel SDS-PAGE 12%. Cache2 est retrouvé dans les fractions (pistes 5-9) récoltées sous le pic d’élution. La piste 1 représente le lysat total avant injection, les pistes 2-4 proviennent du flow-through récoltés après 50, 100, 200 et 300 ml d’injection.
2.2.3.2 Chromatographie échangeuses d’anions
L’échantillon est chargé sur une colonne de sépharose tapissée de groupements diethylaminoethyl chargés positivement, (DEAE SE, GE Healthcare) après avoir été préalablement équilibré dans un tampon B contenant 50 mM de sodium phosphate pH 7.4 et 8 M d’urée. Cette colonne est branchée sur le système FPLC (Äkta pure. GE Healthcare) et l’évolution de la chromatographie est suivie en mesurant l’absorbance à 280 nm. Une fois la totalité de l’échantillon chargée, la colonne est rincée avec le tampon B jusqu'à ce que l’absorbance retourne à sa valeur de base. La protéine Cache2 est ensuite décrochée de la colonne en augmentant linéairement la concentration de NaCl jusqu’à une valeur de 1M dans le tampon B (Figure 21A). Les fractions récoltées sont analysées sur gel SDS-PAGE 12% colorées au bleu de Coomassie (Figure 21B). Les échantillons correspondant à la protéine Cache2 sont regroupés. A l’issue de ces deux étapes de purification, l’échantillon ne contient plus de protéines contaminantes et la protéine Cache2 est considéré comme pure.
Figure 21. Deuxième étape de purification de la protéine Cache2. A. Profil typique d’élution de Cache2 sur colonne échangeuses d’anions. Les protéines non liées à la colonne se retrouvent dans le flow-though. La protéine Cache2 est décrochée dans un pic unique à une concentration de 100 mM NaCl (gradient de NaCl représenté par une
rampe bleue). B. L’analyse par SDS-PAGE 12% des fractions sous le pic d’élution indiqué par une flèche rouge (piste 4, 5 et 6) montre que Cache2 (25 kDa) est la protéine majoritaire dans l’échantillon. Les pistes 1 et 2 correspondantes à l’échantillon avant l’injection sur la colonne et la piste 3 est la fraction avant le gradient d’élution (x = 39 ml).
2.2.3.3 Repliement de la protéine Cache2
L’échantillon contenant la protéine Cache2 pure est dilué dans un tampon C contenant 50 mM de sodium phosphate pH 7.4, 300 mM de NaCl, 0.5 M de L-arginine (Sigma-Aldrich) et 1 mM de dithiothreitol (Sigma-Aldrich), jusqu'à obtenir une concentration protéique de 0.1 mg/ml. L’échantillon dilué est ensuite disposé dans une pochette de dialyse (Sigma-Aldrich) immergé dans le tampon C toute la nuit, sur un agitateur à 4 °C dans le but d’éliminer l’urée. Le repliement de la protéine s’effectue grâce à l’élimination progressive de l’urée dans l’échantillon.
2.2.3.4 Chromatographie d’exclusion stérique
Le repliement et la stabilité de la protéine Cache2 est vérifié par chromatographie d’exclusion stérique à l’aide d’une colonne Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) préalablement équilibré dans un tampon D (50 mM de sodium phosphate pH 7.4, 300 mM de NaCl). Cette technique permet de séparer les protéines en fonction de leurs rayons hydrodynamiques, une mesure qui prend en compte à la fois la forme et la couche d’hydratation de la protéine. Le volume d’élution est directement corrélé au rayon hydrodynamique et peut être calculé à l’aide d’une courbe d’étalonnage réalisé à l’aide de protéines standard de poids moléculaire connu (1350 à 600000 daltons). La protéine Cache2 est éluée après 15.9 ml (Figure 22A), ce qui correspond à un poids moléculaire apparent de 21 kDa et s’apparente à son poids moléculaire théorique de 24.9 kDa. La fraction d’élution obtenue à 15.9 ml analysée sur gel SDS-PAGE 15 % montre que Cache2 est pure et migre à son poids moléculaire attendu (Figure 22B).
Figure 22. Dernière étape de purification de Cache2. A. Profil typique d’élution de la chromatographie d’exclusion stérique de Cache2 à un volume de 15.9 ml. B. Analyse par SDS-PAGE 12% de la fraction récoltée sous le pic d’élution, indiqué par une flèche rouge, à 15.9 ml. La protéine Cache2 purifiée migre à son poids moléculaire attendu de 25 kDa.