Domaines structuraux

CaVa2d1 est composé de plusieurs domaines structuraux conservés à travers les espèces et les différentes isoformes incluant un domaine « Von Willebrand Factor A » ou VWA et quatre domaines Cache pour « Calcium Channel CHEmotaxis Receptor » (Figure

15). Ces domaines extracellulaires ont été identifiés par leur forte identité de séquence

primaire avec des domaines structuraux connus.

Le domaine VWA a été identifié pour la première fois chez le facteur de Von Willebrand, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire jouant un rôle dans l’homéostasie et l’agrégation plaquettaire (Bork & Rohde, 1991). Il s’est ensuite avéré que ce même domaine était particulièrement répandu dans les protéines d’adhésion telles que le collagène et les récepteurs aux intégrines. Plus largement, il a été montré que ce domaine, présent dans plus de 40 000 protéines eucaryotes, exerce un rôle dans l’adhésion cellulaire et dans les interactions protéine-protéine ou protéine-ligand (Whittaker & Hynes, 2002). Le domaine VWA des différentes protéines possède une similarité de séquence limitée mais suffisante pour assurer un repliement caractéristique dit « Rossmann fold » qui consiste en une alternance de feuillet- b-hélice-a-feuillet-b dans laquelle les feuillets-b sont pris en sandwich par de multiple hélices-a. Ce domaine possède aussi la particularité d’avoir un motif MIDAS « Metal Ion

Dependant Adhesion Site ». Ce motif, comme son nom l’indique, est capable de lier des

cations divalents tel que le Ca2+_{, Mg}2+ _{et Zn}2+_{. Il existe des motifs MIDAS dit « parfaits »} constitués de 5 acides aminés situés sur 3 boucles différentes ayant la séquence consensus suivante Asp-Xaa-Ser-Xaa-Ser…Thr…Asp. Dans la structure 3D de la protéine CaVa2d1, les cinq premiers résidus (Asp- Xaa-Ser-Xaa-Ser) sont situés sur la boucle 1, tandis que la Thr est située sur la boucle 2 (à environ 70 résidus de la Ser) et le dernier Asp sur la boucle 3 (à environ 100 résidus de la Ser) (Springer, 2006). L’abréviation Xaa représente n’importe quel acide aminé. Les chaines latérales de ces résidus sont orientées de manière à stabiliser, dans son centre, le cation divalent. Ce domaine a été particulièrement étudié chez les protéines qui appartiennent à la famille des intégrines. En effet, il a été montré que l’interaction intégrine- ligand nécessite la liaison d’un cation divalent par les cinq résidus MIDAS de l’intégrine afin de structurer le domaine dans une conformation qui permettait la coordination de l’ion divalent par une 6ème _{liaison provenant du carboxylate d’un résidu aspartate fournit par le}

ligand (Plow, Haas, Zhang, Loftus, & Smith, 2000). Ainsi, il a été suggéré que la liaison des intégrines avec leurs ligands sont médiée à travers des interactions électrostatiques de type van Der Waals (Emsley, Knight, Farndale, Barnes, & Liddington, 2000). CaVa2d1 contient au sein de son domaine VWA un motif MIDAS « parfait » composé des acides aminés Asp-259, Ser- 261, Ser-263, Thr-331 et Asp-363 (Canti et al., 2005). Le mécanisme moléculaire gouvernant l’interaction entre CaVa2d1 et la sous-unité CaVa1 n’est pas connu mais pourrait impliquer le motif MIDAS de CaVa2d1 et un résidu aspartate de CaVa1 .

Avant la publication de la première structure 3D du complexe calcique CaV1.1, il était prédit que CaVa2d1 contenait seulement un seul domaine structural Cache (Dolphin, 2013). Or, la structure 3D publiée en 2015 mentionnée la présence de 2 domaines Cache (Cache1 et Cache2) tandis que la structure 3D publiée en 2016 a révélé que CaVa2d1 été constitué de 4 domaines Cache (Cache1, Cache2, Cache3 et Cache4) (J. Wu et al., 2016a; J. Wu et al., 2015). Il s’est avéré que plusieurs régions des domaines Cache ne sont pas contigües sur la séquence primaire bien que l’organisation 3D de la protéine montre que le domaine Cache1 est situé du côté N-terminal du domaine VWA, lui-même suivi par les domaines Cache2, 3 et 4. Dans la structure 3D, le domaine VWA fait face à CaVa1 tandis que les domaines Cache se projettent vers le milieu externe (J. Wu et al., 2016a). Le domaine Cache1 fait contact avec le domaine Cache2, qui lui-même est en contact avec le domaine Cache3 qui interagit avec Cache4. Dans la littérature, le domaine Cache est un domaine sensoriel extracellulaire d’abord identifié dans des protéines provenant d’organisme procaryotes (bactéries) telles que les histidines kinases de classe I et l’adénylate cyclase (Zhulin, Nikolskaya, & Galperin, 2003). Ce domaine est homologue aux protéines PAS (Per-Arnt-Sim), qui ont été décrites comme des senseurs intracellulaires (Zhulin, Taylor, & Dixon, 1997). Il a été ainsi postulé que le domaine extracellulaire Cache serait l’évolution du domaine intracellulaire PAS (Upadhyay, Fleetwood, Adebali, Finn, & Zhulin, 2016). Des études ont reporté que, chez les procaryotes, le domaine Cache jouerait un rôle de percepteur sensoriel des nutriments et serait capable de lier de nombreux ligands tels que des acides aminés et des acides organiques (pyruvate, malate, acétate, urée) (Kneuper et al., 2005; Meier, Muschler, & Scharf, 2007). D’un point de vue structural, le domaine Cache est composé du coté N-terminal de trois feuillets-b et d’une hélice-a tandis que le domaine C-terminal est replié en feuillets-b suivi par une région

déstructurée. La fonction exacte de ce domaine est encore à l’étude bien qu’il pourrait intervenir dans des voies de transduction du signal chez les protéines eucaryotes (Anantharaman & Aravind, 2000).

Le domaine VWA de la protéine CaVa2d1 possède un site à haute affinité (KD = 59 nM) pour la gabapentine (1-aminomethylcyclohexane acetic acid) (Field et al., 2006; Marais, Klugbauer, & Hofmann, 2001) et son analogue la prégabaline (Joshi & Taylor, 2006). Ces médicaments sont actuellement commercialisés sous les appellations Neurontin© et Lyrica© respectivement et sont utilisés dans le traitement des crises d’épilepsie et le soulagement des douleurs neurologiques. Des études par mutagénèse dirigée ont montré que le résidu Arg-217 dans l’isoforme de porc (équivalent de Arg-241 chez la souris et le rat), situé sur un motif constitué de 3 arginines consécutives, serait responsable de l’interaction gabapentine-CaVa2d1 (M. Wang, Offord, Oxender, & Su, 1999). De surcroît, des souris transgéniques portant la mutation de Arg-241 en alanine ont montré une sensibilité à la gabapentine fortement diminuée tandis que les effets de la prégabaline étaient également limités (Taylor, 2004). Le mécanisme d’action de la gabapentine sur CaVa2d1 n’est pas connu, néanmoins il a été postulé que l’interaction de la gabapentine avec CaVa2d1 diminuerait l’excitabilité neuronale en réduisant les courants calciques à travers CaVa1 (Chincholkar, 2018). D’après les données récentes sur la structure 3D du complexe calcique de lapin, l’Arg-241 est localisé à l’extrémité distale du domaine VWA (par rapport à la membrane) de CaVa2d1, à proximité du domaine Cache2. En revanche, ce résidu est situé à environ 40 Å de l’interface protéine-protéine avec CaVa1S ce qui exclut que la liaison de la gabapentine puisse empêcher l’interaction directe entre CaVa2d1 et CaVa1. D’autres études ont suggérés que la liaison de la gabapentine réduirait l’interaction de CaVa2d1 avec d’autres protéines synaptiques tel que la thrombospondine, ce qui aurait pour conséquence une réduction de la migration et du relargage des vésicules contenant les neurotransmetteurs (Eroglu et al., 2009; Rogawski & Taylor, 2006).

Figure 15. Organisation structurale de la protéine CaVa2d1 de rat. Les cinq

domaines de CaVa2 sont représentés : Cache1, VWA, Cache2, Cache3 et Cache4. Les 16 sites de N-glycosylation sont indiqués au-dessus de chaque domaine. Les positions des quatre ponts disulfures reliant la sous-unités CaVa2 avec CaVd1 sont identifiés en lignes pointillées. L’ancre GPI est située sur la cystéine 1059. Les sites correspondant à cinq mutations identifiée chez CaVa2d1 qui ont été associés avec des arythmies cardiaques de type QT court (Image extraite de (Briot, Tetreault, Bourdin, & Parent, 2017)).

La poids moléculaire élevé et les nombreuses modifications post-traductionnelles de CaVa2d1 expliquent en partie l’absence de structure 3D à haute résolution de cette protéine. En effet, l’ensemble de ces caractéristiques rende complexe son étude en système bactérien. Ce système est généralement utilisé dans le but d’obtenir des quantités de protéine de l’ordre du mg/ml, nécessaire pour la détermination de la structure 3D à haute résolution par cristallographie aux rayons X.