Protocole expérimental .1 Chronologie

La culture cellulaire commence par une période de 3 jours de stabilisation dans l'incubateur (J-3 à J1). A J1, les boîtes de Pétri contenant chacune 6 explants comme décrit à la phase 2 (p. 42) sont divisées en un groupe stimulé (S) et un groupe témoin (T). La culture cellulaire se poursuit pendant 12 jours incluant pour le groupe S, 40 minutes de stimulation chaque jour durant 11 jours.

Les prélèvements de 12 explants provenant chacun d'une des huit conditions expérimentales ont été réalisés à cinq temps d'échantillonnage. Le premier à J-3 lors de la découpe des explants à l'aide du Punch Biopsy, le second à J1 juste avant la première stimulation, suivi de trois prélèvements à J4, J7 et J12 pour le groupe témoin et le groupe stimulé. Pour le groupe stimulé, J4S correspond à 3 périodes de stimulation plus 24h, J7S 6 périodes de stimulation plus 24h et J12S 11 périodes de stimulation plus 24h (fig. 13).

Le protocole complet de culture cellulaire a été réalisé à 3 reprises à partir de 3 épidermes provenant d'abdominoplastie de sujets distincts et les ARN des explants ont été analysés grâce à 24 puces microarrays Affymetrix GeneChip^® human genome U133 Plus 2.0.

4.3.2 Prélèvement des explants et extraction de l'ARN

Pour récolter la quantité minimale d'ARN nécessaire à la réalisation de l'analyse microarray, 12 explants placés sur 2 supports dermiques, chacun mis en culture dans une boîte de Pétri, sont nécessaires pour chaque condition d'échantillonnage. Une culture complète nécessite 14 supports dermiques et 96 explants épidermiques. Le protocole microarray réalisé à partir de 3 épidermes différents utilise donc 288 explants et 42 supports dermiques.

4.3.2.1 Procédure

Les 12 explants sont détachés stérilement des 2 dermes à l'aide d'une lame de bistouri et d'une pince puis sont immédiatement placés dans une solution de RNAlater^* à -20°C.

Lorsque l'ensemble des échantillons a été prélevé, les 12 explants de chaque temps d'échantillonnage sont homogénéisés à l'aide d'un homogénéiseur rotor-stator Silent Crusher S Heidolph utilisant une tête 3F pour les volumes de 0,8 à 1 ml (pour microtubes type Eppendorf) en présence de Buffer RLT^*.

QIAshredder^* afin d'améliorer l'homogénéisation et filtrer les débris insolubles. L'étape optionnelle "RNase-Free DNase Set" est intégrée au protocole d'extraction afin d'éliminer toutes traces d'ADN des échantillons.

Exemple :

- J4T : échantillonnage au 4ème jour de culture après l'attachement des explants groupe témoin. - J7S : échantillonnage au 7ème jour de culture après l'attachement des explants et 6 périodes

de 40 minutes de stimulation, groupe stimulé.

Figure 13 : schéma expérimental

4.3.2.2 Mise au point de l'extraction de l'ARN : quantité et qualité des échantillons

Deux supports dermiques avec les épidermes de deux donneurs différents ont servi à déterminer le nombre d'explants à prélever lors de chaque échantillonnage.

- Homogénéisation au rotor-stator : ▪ Choix de l'appareil :

▪ deux homogénéiseurs ont été testés afin de déterminer l'appareil "mixant" le mieux les explants. Le choix s'est porté sur le modèle Silent Crusher S Heidolph avec la tête 3F pour les volumes de 0,8 à 1 ml en microtubes.

▪ Utilisation :

▪ sur un lit de glace, les explants prélevés à différents temps de culture sont homogénéisés à l'aide du rotor-stator dans une solution de lyse (Buffer RLT, β-ME).

- Extraction de l'ARN :

▪ Suivant la procédure "Protocol Animal Tissues" du kit " RNeasy Mini" (Qiagen®).

J₄S J₁₂S

J_-3

J₁T J₄T J₇T J₁₂T

Echantillonnage Attachement des explants / pas de stimulation

Stimulation : 40 min Groupe témoin / pas de stimulation

Identification des échantillons Groupe stimulé / stimulation

J-3, J1T, J4T, J7T, J12T, J4S, J7S, J12S

avec J = Jour; T = Témoin; S = Stimulé Unité de temps : 1 jour

J₇S Groupe stimulé Groupe témoin -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- Mesure de la quantité, qualité et pureté des échantillons :

▪ On peut estimer l'extraction d'ARN à 500ng/explants pour un échantillonnage à J12T. ▪ Une étape de filtration sur colonne QIAshredder est ajoutée au protocole d'extraction

afin d'améliorer l'homogénéisation et la purification des échantillons d'ARN.

▪ La migration sur gel de l'échantillon d'ARN montre une contamination par de l'ADN. Lors de l'extraction, une étape de traitement par DNase a été utilisée pour résoudre le problème.

4.3.3 Analyse de l'expression des gènes

a. Intérêt de la technique

Les microarrays (puces à ADN) permettent d'analyser le niveau d'expression de gènes, voire du génome complet, d'une cellule ou d'un tissu par rapport à un échantillon de référence. La technique est rappelée à l'annexe 2 (p. 146).

b. Choix de la puce microarray

Le but est de rechercher les gènes dont l'expression a été modifiée par la stimulation électrique. Nous avons opté pour la puce microarray Affymetrix GeneChip^® human genome U133 Plus 2.0 qui permet l'analyse sur 38.500 gènes, soit l'ensemble du génome humain [Affymetrix].

c. Protocole

Nous avons réalisé le protocole en collaboration avec PartnerChip (Commissariat à l'Energie Atomique (CEA), Evry France). Les échantillons ont été préparés et hybridés selon le protocole Affymetrix double-cycle prévu pour les échantillons ayant, après extraction, une quantité en ARNtotal comprise entre 10 et 100ng. Il comprend un cycle supplémentaire pour la synthèse des ADN complémentaires^* (ADNc) suivi d'une amplification afin d'obtenir des quantités ARNc marqués suffisantes pour une analyse avec les puces microarrays.

La fluorescence est détectée à l'aide d'un scanner Affymetrix GeneChip^® 3000. Les données d'expression ont été générées en utilisant le logiciel Affymetrix GCOS. Le contrôle qualité des puces a été réalisé sur base du rapport 3'/5' des sondes^* contrôles "glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase" et "β-actine".

4.3.3.2 Validation : qRT-PCR

Nous avons validé les résultats obtenus avec les puces microarrays en analysant par qRT-PCR l'expression de 5 transcrits à partir d'ARN provenant des 3 cultures épidermiques pour l'ensemble des temps d'échantillonnage (excepté pour un sujet au temps J7 et J12 par manque d'ARN). Les gènes choisis pour cette validation ont été sélectionnés après une première analyse des résultats microarrays (chap. 5.2.1.2, p. 59).

a. Technique

La PCR, technique d'amplification de l'ADN in vitro, permet de repérer un fragment d'ADN ou de gène défini, même présent en quantité infime, et d'en obtenir un grand nombre de copies. La

réel" le processus d’amplification PCR en détectant la fluorescence émise par les produits de PCR néo formés et d'ainsi connaître la quantité d'ADN formé à chaque instant.

Le fonctionnement de la technique est rappelé à l'annexe 3 (p. 150).

b. Sélection des amorces

Les amorces^* (primers) sont sélectionnées à l'aide du logiciel Primer3¹ [Koressaar et al., 2007; Untergrasser et al., 2012] utilisant une séquence FASTA^* obtenue sur le site du National Center for Biotechnology Information2. Elles ont été vérifiées par le logiciel Standard Nucleotide BLAST³.

c. Choix des gènes de normalisation

La normalisation de l'expression a été faite avec la beta-2-microglobulin (B2M) et TATA box-binding protein, deux gènes faisant partie d'une liste proposée par Allen et al. [2008] comme référence de normalisation pour les qRT-PCR réalisées sur les kératinocytes humains. Nos résultats microarrays montrent également des taux d'expressions similaires pour ces deux gènes dans les échantillons témoins et stimulés.