Faculté de Médecine

Faculté de Médecine

Laboratoire de Recherche en Orthopédie Traumatologie (LROT)

Etude des effets d’un courant électrique pulsé de basses fréquences

sur les kératinocytes humains

Jean-François Collard

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de

Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Devant le Jury composé des Professeurs :

Faculté de Médecine

Laboratoire de Recherche en Orthopédie Traumatologie (LROT)

Etude des effets d’un courant électrique pulsé de basses fréquences

sur les kératinocytes humains

Jean-François Collard

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de

Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Devant le Jury composé des Professeurs :

Philippe LEBRUN (Président - ULB)

Maurice HINSENKAMP (Promoteur - ULB)

Carine MAENHAUT (Secrétaire - ULB)

Véronique DEL MARMOL (ULB) Marcel ROOZE (ULB)

Remerciements

Je suis conscient que ce travail a été rendu possible grâce à la confiance que me témoigne le Pr. Hinsenkamp depuis plusieurs années. C'est un réel plaisir de discuter Sciences avec lui et de confronter nos idées. Je suis sincèrement reconnaissant pour l'autonomie et les nombreuses responsabilités qu'il m'a confiées au fil des années. Le terme le plus juste et pourtant si simple que m'offre la langue française pour lui témoigner ma gratitude est le mot "Merci".

Je remercie le Président de mon Comité d'Accompagnement, le Pr. Rooze, ainsi que ses Membres, les Prs. Maenhaut, Verschaeve et Hinsenkamp, pour les conseils et l'intérêt porté à ce travail ainsi que pour le soutien apporté lorsque certaines difficultés se sont présentées.

Il n'est pas possible de parler de cet écrit sans remercier le Pr. Burny pour ses nombreuses lectures, corrections et simplifications. Son œil averti et ses remarques ont été précieux pour améliorer et organiser ce texte. Je remercie également Monique Donkerwolcke, Sylvie Fourez et ma petite maman pour leur aide dans la recherche des coquilles, la correction orthographique et pour leur soutien.

J'ai également une pensée pour le Dr. Mukisi que je revois assis il y a quelques années dans ce bureau surchauffé pour terminer sa thèse avec le Pr. Burny; j'ai souvent songé à lui durant la rédaction pour me donner du courage…

Je remercie les Ingénieurs du Beams et du LISA de l'ULB et tout particulièrement le Dr. Mertens et Nicolas Juliemont pour leur aide précieuse lors des mesures et de l'analyse des paramètres électriques utilisés dans ce travail.

Merci au Pr. Maenhaut de m'avoir ouvert son laboratoire pour y réaliser les PCR et au Dr. Dom pour sa sympathie et ses précieux conseils.

Je souhaite remercier le Pr. de Maertelaer pour ses avis et conseils avisés dans le domaine des statistiques.

Merci au Pr. Soularue pour notre fructueuse collaboration et à son équipe pour leur accueil au sein de PartnerChip (Commissariat à l'Energie Atomique (CEA), Evry France). Je remercie tout particulièrement le Dr. Baulade pour son aide et ses conseils dans l'analyse des échantillons microarrays.

Résumé

Ces dernières décennies, les populations, civiles en général et professionnelles en particulier, ont été soumises à une exposition croissante aux champs électriques (EF) et magnétiques (MF) d'extrêmement basses fréquences (ELF). Différentes réponses biologiques ont été observées sur différents types de cellules et de tissus exposés à des courants et des champs ELF. Ces études permettent une meilleure connaissance de notre environnement électromagnétique mais les mécanismes biologiques précis et les implications des fréquences ELF sur la santé restent peu connus. Il est nécessaire de développer des protocoles de recherche pour répondre à ces questions.

La revue exhaustive de la littérature met clairement en avant :

- le manque de connaissance des mécanismes cellulaires activés après stimulation ELF; - l'importance de leur étude pour toutes recherches liées à l'utilisation de la stimulation ELF; - l'efficacité des techniques omiques qui permettent l'identification de ces mécanismes

cellulaires;

- l'importance du choix des modèles expérimentaux utilisés afin de faciliter l'extrapolation des résultats chez l'homme.

Pour répondre à ces observations, nous avons recherché les gènes et les mécanismes cellulaires impliqués lors de la stimulation ELF sur un modèle de culture d'explants de kératinocytes humains mis en culture sur support dermique dévitalisé et stimulé par un courant électrique pulsé. Nous pensons que la recherche sur un modèle humain in vitro permet d'obtenir des résultats plus intéressants pouvant être extrapolés plus facilement aux études épidémiologiques ou cliniques.

Les résultats préliminaires obtenus sur ce modèle de culture par Hinsenkamp et al. aboutissent à la même conclusion que leurs études des effets des champs sur le tissu osseux. Ils ont observés à partir de différents modèles, une maturation plus rapide de la matrice cartilagineuse associée à une accélération de l'ossification des tissus embryonnaires.

Les analyses microarrays ont été réalisées sur 288 explants d'épiderme provenant de 3 cultures cellulaires indépendantes utilisant l'épiderme de 3 sujets différents. La première analyse des résultats montre que, pour un certain nombre de sondes, la valeur du taux d'expression est différente lorsque l'on compare deux à deux les conditions d'échantillonnage. Cette observation est valable pour l'évolution naturelle au cours du temps des cultures témoins (J4T/J1T : 296

sondes; J7T/J1T : 702 sondes; J12T/J1T : 1006 sondes) ou des cultures stimulées (J4S/J1T : 941

sondes; J7S/J1T : 625 sondes; J12S/J1T : 946 sondes) ainsi que pour la comparaison d'un temps

stimulé à son temps témoin (J4S/J4T : 304 sondes; J7S/J7T : 220 sondes; J12S/J12T : 496 sondes).

L'analyse de l'évolution des résultats au cours du temps (comparaison de Jx à J1) pour le groupe

témoin et stimulé montre que, si la stimulation augmente ou diminue la régulation de certains gènes par rapport à J1 (témoin), la variation n'est généralement pas suffisante pour

témoin respectif : TXNRD1, ATF3 et MME. Ils sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation et la mitose.

L'analyse du rôle joué par DKK1 et MACF1 au temps J4 montre que la sur-expression de DKK1

et la sous-expression de MACF1 ont pour effet l'inhibition du "pathway Wnt" ce qui provoque une diminution de la prolifération et une augmentation de la différenciation terminale.

Parmi les variations intéressantes, BMP-2 est sur-exprimée au temps J12. Cette protéine est

connue pour jouer un rôle important dans l'ostéogenèse, l'angiogenèse et la maturation cellulaire. Une analyse par triangulation montre que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-expression de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé), auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente. Parmi ces gènes, CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération et la différenciation; UBE2D3 est actif dans la voie de signalisation de la BMP-2; les autres gènes sont actifs dans la mitose, le développement cellulaire et la réplication de l'ADN. Nous avons ensuite utilisé des outils informatiques qui permettent une analyse sans apriori des résultats :

L'analyse du graphe orienté acyclique généré par WebGestalt sur base des données de GO a mis en évidence les processus biologiques impliquant les gènes présents dans nos résultats et dont la régulation a été modifiée. Ces gènes ont des fonctions dans les mécanismes du cycle cellulaire, de la mitose, de la prolifération ou de la différenciation. Ces résultats sont cohérents avec les résultats macroscopiques précédents et les premières observations présentées ci-dessus.

Pour mettre en évidence les voies de signalisation actives dans les processus biologiques, nous avons utilisé KEGG qui indique que les voies "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" utilisent un nombre statistiquement significatif de gènes présents dans nos résultats. Le cycle cellulaire et la mitose sont impliqués dans la prolifération cellulaire. La différenciation a également besoin de cette étape proliférative puisque ce sont les cellules filles qui deviendront des cellules matures. La "voie de signalisation p53" est également active dans le cycle cellulaire, la différenciation, l'apoptose et le maintien de l'intégrité cellulaire.

L'analyse des voies connexes à "p53" et à "cycle cellulaire", utilisant des gènes présents dans nos résultats, a mis en avant plusieurs cascades dont certaines utilisent des gènes actuellement connus pour n'avoir de rôle que dans une seule cascade. Ces gènes sont des candidats potentiels à la fonction de marqueur de la stimulation ELF. On y retrouve entre autre FoxO : régulé par JNK (membre des MAPK), actif avec TGF-β1 dans la migration cellulaire et la diminution de l'apoptose; Jak/STAT qui active la voie "cytokine-cytokine receptor interaction" utile lors de la prolifération, différenciation, migration, apoptose et survie cellulaire; Wnt qui régule la prolifération, la différenciation ainsi que la mobilité cellulaire. D'autres voies d'intérêt mais n'utilisant pas de gène ayant une fonction unique ont été listées : PI3K/Akt, en partie régulée par la phosphorylation de FoxO, a une fonction dans la prolifération cellulaire.

La recherche des mécanismes utilisant les gènes isolés lors de l'analyse par triangulation les relie à la prolifération, la différenciation, l'adhésion cellulaire, la réplication de l'ADN et la mort cellulaire.

Pathway Studio nous a permis de localiser dans la cellule les protéines qui devraient finalement être traduites suite à la modification de l'expression de leurs gènes. Cette analyse permet d'étudier les interactions entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule ainsi que rechercher les protéines stimulant un grand nombre d'autres protéines ou recevant un grand nombre de stimuli. La protéine extracellulaire Endothelin 1 (ET-1), codée par le gène EDN1, agit sur 9 protéines membranaires différentes : EGFR par l'intermédiaire de la signalisation des MAPK; PDGFRA; GLUT-3 (exprimé à partir du gène SLC2A3); COX-2 (exprimée à partir du gène PTGS2); EP4 (exprimée à partir du gène PTGER4); PLAUR et les gènes IER3, CD44 et IL6ST qui seront traduits en protéines membranaires. Neuregulin 1, codée par le gène NRG1, est la seconde protéine extracellulaire la plus active vers les protéines membranaires différentes.

L'analyse des résultats met en évidence 840 interactions entre une protéine extracellulaire et une protéine nucléaire en incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. Les protéines membranaires recevant des informations du plus grand nombre de protéines extracellulaires sont EGFR et FAS. C'est également EGFR, une des voies de signalisation les plus importantes de la régulation de la croissance, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire, qui transmet le plus d'informations aux protéines cytoplasmiques. FAS est capable de réguler l'apoptose et la prolifération en fonction du taux de fixation de son ligand.

A l'aide d'un screening par la technique des microarrays de l'expression des gènes réalisé sur des échantillons témoins et stimulés, nous avons :

- vérifié la cohérence des résultats avec les études historiques;

- mis en évidence les processus biologiques responsables de la réponse cellulaire observée; - isolé une liste de gènes "marqueurs potentiels" impliqués spécifiquement dans ces

mécanismes:

- vérifié l'hypothèse que la stimulation ELF accélère dans le temps l'apparition de phénomènes qui seraient apparus naturellement mais avec une latence plus longue.

Les observations faites dans le cadre de cette étude ont mis en évidence un nombre important d'informations. Plusieurs d'entre elles nécessitent des recherches complémentaires afin de préciser et de confirmer les résultats. Il serait intéressant :

- de comparer et de grouper les résultats de la littérature montrant des effets similaires même si la stimulation ou le modèle de culture sont différents;

- de développer les techniques de microdosimétrie afin de connaître avec précision la stimulation reçue par la cellule;

- de développer l'étude des signaux afin de découvrir la composante active qui déclenche la réaction de la cellule;

Abstract

In recent decades, populations, civil in general and professional in particular, are subjected to increasing exposure of extremely low frequency (ELF) electric (EF) and magnetic (MF) fields. Several biological responses have been observed in different cell types and tissues exposed to currents and ELF fields. These studies contribute to a better knowledge of our electromagnetic environment but the precise biological mechanisms and implications on health of ELF frequencies remain unclear. It is necessary to develop research protocols to answer these questions.

The comprehensive review of the literature clearly puts forward:

- lack of knowledge of cellular mechanisms activated after ELF stimulation; - importance of their study for all researches related to the use of ELF stimulation; - omic techniques efficiency for identification of cellular mechanisms;

- importance in the choice of experimental models used to allow extrapolation in humans. In response to these observations, we looked for genes and cellular mechanisms involved after ELF stimulation on a model of human keratinocyte explants cultured on devitalized dermal support and stimulated by a pulsed electric current. We think that research on in vitro human model provides more interesting results and can be extrapolated easily to epidemiological or clinical studies.

Preliminary results of this model of culture obtained by Hinsenkamp et al. arrive at the same conclusion that their studies of the effects of fields on bone tissues where a faster maturation of cartilage matrix associated with the acceleration of the ossification of embryonic tissue models were observed.

The first analysis of microarrays results obtained on cell cultures carried out independently with 288 skin explants from three different subjects shows, for some probes, that the expression level value is different when comparing two by two sampling conditions. This is true for the natural evolution during time of the control cultures (D4T/D1T: 296 probes; D7T/D1T: 702 probes;

D12T/D1T: 1006 probes) and stimulated cultures (D4S/D1T: 941 probes; D7S/D1T: 625 probes;

D12S/D1T: 946 probes) and for comparison of a stimulated sampling time to its control

(D4S/D4T: 304 probes; D7S/D7T: 220 probes; D12S/D12T: 496 probes).

Analysis of the results over time (comparison of Dx with D1) for control and stimulated group

shows, if the stimulation increases or decreases the regulation of some genes compared to D1

(control), that the variation is usually not sufficient to statistically reverse the direction of the natural regulation observed over time. Only 3 genes (EPS8, ADAMTS1, NOS1) do not follow this rule.

Furthermore, comparison of gene lists at the three sampling time D4, D7 and D12, shows that

three genes are consistently expressed in the three stimulated groups compared to their respective control: TXNRD1, ATF3 and MME. They are known to play a role in proliferation, differentiation and mitosis.

Analysis of role of DKK1 and MACF1 at D4 shows that DKK1 over-expression and MACF1

Another interesting variation, BMP-2 is over-expressed at D12 sampling time. This protein is

known to play an important role in osteogenesis, angiogenesis, and cell maturation.

An analysis by triangulation method shows that stimulation by pulsed ELF current accelerates the up- or down-regulation of some genes that, under normal circumstances (unstimulated controls) have followed overtime the same trend (up-or down-regulation) but more slowly. Among these, CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 are known to play a role in proliferation and differentiation; UBE2D3 is active in the signaling pathway of BMP-2; the other genes are involved in mitosis, cell growth and DNA replication.

Then, we used bio-informatics tools to analyze the results without a priori:

Analysis of directed acyclic graph generated by WebGestalt based on GO data showed biological processes involving the genes of our results. These genes have functions in the mechanisms of cell cycle, mitosis, proliferation or differentiation. These results are consistent with previous macroscopic results and the first observations presented above.

To highlight the signaling pathways active in biological processes, we used KEGG and the results indicate that "cell cycle" and "p53 signaling pathway" use a significant number of genes present in our results. Cell cycle and mitosis are involved in cell proliferation. Differentiation also needs this proliferative step since these are the sister cells who will become mature cells. "p53 signaling pathway" is also active in cell cycle, differentiation, apoptosis, and the maintenance of cellular integrity.

Analysis of related pathways "p53" and "cell cycle", using genes from our results, highlighted several cascades using genes known to have a function only in one cascade. These genes are potential candidates as marker of ELF stimulation. We find FoxO, regulated by JNK (MAPK Member), active with TGF-β1 in cell migration and decreased of apoptosis; Jak/STAT pathway that activates the "cytokine-cytokine receptor interaction" useful in proliferation, differentiation, migration, apoptosis and cell survival; Wnt which regulates proliferation, differentiation and cell motility. Other pathways of interest but not using a gene having a single function were listed: PI3K/Akt pathway, in part regulated by FoxO phosphorylation, has a function in cell proliferation.

The various analyzes conducted with Pathway Studio confirm that a great majority of genes of our results are active in the processes of proliferation, differentiation, cell growth, cell cycle, mitosis, apoptosis, migration and cell survival. Several genes and mechanisms discussed above (ADAMTS1, ATF3, BMP-2, DKK1, DUSP4, MACF1, MME, PDGFRA, SFRP1, TXNRD1, WNT) were isolated by the software.

Search of mechanisms using genes isolated during triangulation analysis highlight proliferation, differentiation, cell adhesion, DNA replication and cell death.

into membrane proteins. Neuregulin 1, encoded by NRG1 gene is the second most active extracellular protein to various membrane proteins.

Analysis of the results shows 840 interaction of extracellular proteins to a nuclear protein including a membrane protein and a cytoplasmic protein. Membrane proteins receiving the largest number of extracellular proteins stimulation are EGFR and FAS. It is also EGFR, one of the most important signaling pathways regulating growth, survival, proliferation and cell differentiation, which transmit most information's to cytoplasmic proteins. FAS is able to regulate apoptosis and proliferation depending of its ligand binding rates.

Using microarray screening of the genes expression realized on different control and stimulated samples, we have:

- verified the consistency of results with historical studies;

- highlighted biological processes responsible of the observed cellular response; - isolated a "potential markers" gene list specifically involved in these mechanisms:

- verified the hypothesis that the ELF stimulation accelerates in time the occurrence of phenomena naturally appearing but with a longer latency.

The observations made in this study showed a significant number of information. Many of them require further research to clarify and confirm the results. It would be interesting:

- to compare and group results from the literature showing similar effects even if stimulation or culture model are different;

- to develop microdosimetry techniques to know with precision the stimulation received by the cell;

- to promote the study of electric signals to discover the active component that triggers the reaction of the cell;

- to establish a protocol studying Wnt pathway on blood cells including a dosage of β-catenin to study the effect of the stimulation on childhood leukemia.

Table

REMERCI RÉSUMÉ ABSTRAC TABLE DE TABLE DE GLOSSAIR CHAPITR 1.1 HI 1.2 RE 1.3 ST 1.3 1.3 1.3 CHAPITR 2.1 INT 2.2 M 2.3 ET 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.4 ET 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.5 ET 2.5 2.5 2.6 CO

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CHAPITR 4.1 M 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.2 CA 4.2 4.3 PR 4.3 4.3 4.3 4.4 ST 4.4 4.4 4.4 4.4 4.5 AN 4.5 4.5 CHAPITR 5.1 AN 5.1 5.1 5.2 AN 5.2 - MATÉRIE E 4 ODÈLE DE CULTU 1.1 Prépar 1.2 Prépar 1.3 Fabrica 1.4 Prépar 1.5 Prépar 1.6 Assem 1.7 Mise a 4.1.7.1 R 4.1.7.2 V 4.1.7.3 V ARACTÉRISTIQUES 2.1 Caract 4.2.1.1 G 4.2.1.2 C ROTOCOLE EXPÉR 3.1 Chrono 3.2 Prélève 4.3.2.1 P 4.3.2.2 M 3.3 Analys 4.3.3.1 M a. b. c. 4.3.3.2 V a. b. c. TATISTIQUE DES M 4.1 Fold Ch 4.4.1.1 R 4.4.1.2 Fo 4.2 Variati 4.3 Norma 4.4 Utilisat

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5.2 5.3 AN 5.3 5.3 5.4 LE 5.4 5.4 5.4 5.5 PA 5.5 5.5 5.6 DI CHAPITR 6.1 PE ANNEXES TABLEAU TABLEAU TABLEAU TABLEAU TABLEAU ANNEXE ANNEXE ANNEXE ANNEXE ANNEXE ANNEXE 7.1 IN BIO 7.2 BO INT 7.3 ST EP PR 7.4 CE CE BIBLIOGR 2.2 Cluster 5.2.2.1 R 5.2.2.2 D NALYSE PAR TRIA

3.1 Résulta 3.2 Discuss S MÉCANISMES C 4.1 GeneO 5.4.1.1 R 5.4.1.2 D 4.2 KEGG m 5.4.2.1 R 5.4.2.2 D 4.3 Site int 5.4.3.1 R 5.4.3.2 D 5.4.3.3 En ATHWAY STUDIO 5.1 Résulta 5.2 Discuss SCUSSION DU PR - CONCLU E 6 ERSPECTIVES ... S 1 - RÉSULTA U A-1 UX A-2A,B,C U A-3 UX A-4A,B,C U A-5 2 - LA TECHN 3 - LA TECHN 4 - LA PEAU .. 5 - NOTIONS 6 - NORMES D 7 - PUBLICAT VITRO STUDY OF OELECTROMAGN ONE MORPHOGE TERNATIONAL O TATISTICAL VALID IDERMAL CELLS E ROGRESS IN BIOP ELLULAR PROCESS ELLULAR SIGNALL RAPHIE ... ring en k-mea ésultats ... iscussion ... NGULATION ... ats ... sion ... CELLULAIRES ... Ontology modu ésultats ... iscussion ... module du site ésultats ... iscussion ... ternet KEGG : ésultats ... iscussion ... n résumé ... ... ats ... sion ... ROTOCOLE EXPÉR SIONS ... ... ATS ... :"LISTE A :LISTES D :PROCESS ,D,E:PROCESS :INTERAC IQUE MICROA IQUE QRT-PC ... DE PHYSIQUE D'EXPOSITION IONS ... F THE EFFECTS OF NETICS 32:28-36 ENIC PROTEIN–M ORTHOPAEDICS 3 ATION OF THE AC EXPOSED TO EXTR PHYSICS AND MO SES INVOLVED IN LING 27:889–9 ... ns... ... ... ... ... ... ...

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ELY LOW FREQUE

Table des abréviations

A549 Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome de cellules épithéliales pulmonaires humaines

ADN Acide DésoxyriboNucléique

ADNc ADN complémentaire

ALL Acute Lymphoblastic Leukemia ou Leucémie Aiguë Lympholastique AML Acute Myeloid Leukemia ou Leucémie Myéloïde Aiguë

ARN Acide RiboNucléique

ARNm ARN messager

Beams Laboratoire Bio, Electro And Mechanical Systems BEMER BioElectroMagnetric Energy Resonance

BGC-823 Lignée cellulaire dérivée d'un cancer gastrique humain BMP Bone Morphogenetic Protein

BMSCs Bone marrow stem cells ou cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse COST European Cooperation in Science and Technology

DAG Directed Acyclic Graph ou graphe orienté acyclique DKK1 Gène Dickkopf Homolog 1

DMEM Dulbecco Modified Eagle's Medium EF Electric Field ou champs électriques EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

EHS Electromagnetic hypersensitivity ou hypersensibilité électromagnétique ELF Extremely Low Frequency ou fréquences extrêmement basses

ELF-EF Extremely Low Frequency Electric Field ou champs électriques d'extrêmement basses fréquences ELF-MF Extremely Low Frequency Magnetic Field ou champs magnétiques d'extrêmement basses fréquences EMF ElectroMagnetic Field ou champs électromagnétiques

F12 Ham's F12 Nutrient Mixture

FBS Fetal Bovine Serum ou sérum de veau foetal

FC Fold Change

FRC Fibroblastic Reticular Cells ou cellules fibroblastiques réticulaires

FCR Relative Fold Change

GAG GlycosAminoGlycanes GO GeneOntology

HaCaT Lignée cellulaire dérivée de kératinocytes humains

hBMSCs Human Bone Marrow Stem Cells ou cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse humaine HepG2 Lignée cellulaire dérivée d'hépatocarcinome humain

hFSFs Fibroblastes de la couche sclérale de foetus humains hMSC cellules souches mésenchymateuses humaines

HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells ou cellules endothéliales de veine ombilicale humaine HV-HVOL High Voltage - High Voltage Overhead power Lines ou ligne électrique aérienne de haut voltage IARC International Agency for Research on Cancer

ICNIRP International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection

IEI-EMF Intolérance idiopathique environnementale attribuée aux champs électromagnétiques J Jour de prélèvement

JNK c-Jun N-terminal kinase

K562 Lignée cellulaire dérivée d'une leucémie myéloïde chronique KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

LIMMA Linear Models for MicroArray

Table des abréviations (suite)

MACF1 Gène microtubule-actine facteur 1 MAPK Mitogen Activated Protein Kinase Mc3T3-E1 Lignée cellulaire ostéoblastique murine MF Magnetic Field ou champs magnétiques

MG63 Lignée cellulaire ostéoblastique dérivée d'un ostéosarcome humain MKN-28 Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome gastrique humain MKN-45 Lignée cellulaire dérivée d'un carcinome gastrique humain MSCs Cellules souches mésenchymateuses

NB69 Lignée cellulaire neuroblastome humain dérivée d'une tumeur de la glande surrénale NDD NeuroDegenerative Disease ou maladies neurodégénératives

NHEK Lignée cellulaire dérivée de kératinocytes épidermiques humains normaux NRPB National Radiological Protection Board

NS Non Significatif

OMS Organisation Mondiale de la Santé OR Odds Ratio ou risque relatif rapproché

PBS Phosphate Buffered Saline ou tampon phosphate salin

PC12 Lignée cellulaire dérivée de cellules de phéochromocytome (affection tumorale des cellules chromaffines de la médullo-surrénale) de rat

PEMF Pulsed ElectroMagnetic Field ou champs électromagnétiques pulsés qRT-PCR quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RAW264.7 Lignée cellulaire dérivée de macrophages de souris

rBMSCs rabbit bone marrow-derived MSCs ou lignée cellulaire dérivée de MSCs de lapin RCA Connecteur Radio Corporation of Amercia, appelé aussi CINCH

S Groupe stimulé

SaOS-2 Lignée cellulaire dérivée d'ostéosarcome humain

SCENIHR Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks SH-SY5Y Lignée cellulaire dérivée de neuroblastome humain

SPC-A1 Lignée cellulaire dérivée d'un adénocarcinome pulmonaire humain

T Groupe témoin

TAMMEF Application thérapeutique des champs électromagnétiques modulés par un signal musical THP-1 Lignée cellulaire monocytaire humaine

VHV-HVOL Very High Voltage - High Voltage Overhead power Lines ou ligne électrique aérienne de très haut voltage VSMCs Culture primaire de cellules de muscles lisses vasculaires aortiques

Glossaire

Abdominoplastie :

Intervention chirurgicale qui consiste à retirer les excédents de graisse abdominale sous-cutanée associée à une ablation de l'excédent de peau.

ADN complémentaire (ADNc) :

Simple brin d'ADN artificiellement synthétisé à partir d'un ARNm, représentant la partie codante de la région du génome ayant été transcrit en cet ARNm.

Amorces ou primers (annexe 3, p. 150) :

Petits brins d'ADN d'environ 20 bases (oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon spécifique grâce à la complémentarité des bases sur son brin d'ADN complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier dans la technique PCR.

Buffer RLT (Qiagen®) :

Le tampon RLT est un tampon de lyse pour cellules et tissus avant isolation de leurs ARN. Cal osseux :

Réaction cicatricielle souvent hypertrophique localisée au foyer de fracture et à proximité aboutissant à la consolidation osseuse.

Cellules souches mésenchymateuses :

Cellules capables de produire plusieurs types de cellules appartenant aux tissus squelettiques, tels que le cartilage, les os et la graisse.

Chitosane :

Polyoside composé de D-glucosamine liée et N-acétyl-D-glucosamine. Il est produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine composant l'exosquelette des arthropodes ou de l'endosquelette des céphalopodes.

Conductivité électrique (σ) (annexe 5.3, p. 163) :

Aptitude d'un matériau ou d'une solution à laisser les charges électriques se déplacer librement, permettant le passage d'un courant électrique.

Dermatome de Wagner :

Instrument chirurgical utilisé pour couper de très fines tranches de peau. Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) :

Milieu de culture utilisé pour l'apport d'éléments nutritifs nécessaires au maintien et à la prolifération de presque tous les types de cellules in vitro. Il est dérivé du Eagle's minimal essential medium (EMEM).

ELISA (technique ELISA) :

FASTA :

Format de fichier texte utilisé pour stocker des séquences biologiques de nature nucléique ou protéique. Ces séquences sont représentées par une suite de lettres codant pour des acides nucléiques ou des acides aminés. Ce format, de par son utilisation très répandue, est devenu un standard de facto en bio-informatique.

Fetal Bovine Serum (FBS) :

Sérum de veau fœtal, issu des fœtus de vache, est le sérum le plus largement utilisé en culture cellulaire. Les protéines globulaires (albumine de sérum bovin) sont le composant majeur de ce sérum. L'importante variété de protéines maintient les cellules en culture dans un milieu favorable à leur survie, croissance et multiplication.

Glycosaminoglycanes (GAG) :

Macromolécules glucidiques composant la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs. Ham's F12 nutrient mixture (F12) :

Milieu de culture développé par Ham. Conçu pour la croissance sans sérum de cellules d'ovaire et de poumon de hamster chinois; il est largement utilisé avec du sérum pour la culture de cellules de mammifères.

Omiques (techniques omiques) :

Techniques permettant une étude au niveau moléculaire de la réponse des gènes (génomique) des protéines (protéomique) et du métabolisme (métabolomique).

Phosphate Buffered Saline (PBS, tampon phosphate salin) :

Solution tampon isotonique contenant du chlorure de sodium, du phosphate disodique, du phosphate monopotassique et un peu de chlorure de potassium. Couramment utilisée en biochimie. Ce tampon sert surtout à rincer les cellules lorsqu'il faut enlever toute trace de milieu avant de les traiter.

Protéomique :

Etude de l'ensemble des protéines d'une cellule, d'un organite, d'un tissu, d'un organe ou d'un organisme à un moment donné et sous des conditions données.

Pseudarthrose :

Absence de consolidation des fragments osseux après une fracture. QIAshredder (Qiagen®) :

Homogénéisateur composé d'un système de "broyage-biopolymère" inclus dans une colonne de microcentrifugation.

qRT-PCR (annexe 3, p. 150) :

PCR : réaction en chaîne par polymérase; RT : reverse transcriptase;

q (ou real-time) : quantitative (ou en temps réel).

Rétinoïdes :

Classe de composés chimiques dérivés de la vitamine A. Ils sont utilisés en médecine pour leur activité de régulation de la croissance et de la différenciation des cellules épithéliales. RNAlater (Qiagen®) :

RNA Stabilization Reagent stabilise immédiatement l'ARN des échantillons tissulaires afin de conserver le profil d'expression génique.

RNeasy Mini Kit (Qiagen®) :

Le kit RNeasy Mini fournit une méthode de purification rapide de l'ARN à partir de cellules, tissus ou levure en utilisant des colonnes à membrane de silice avec une capacité de liaison de 100μg d'ARN.

Sonde (ou probe) :

En biologie moléculaire, une sonde d'hybridation est un fragment d'ADN ou d'ARN de longueur variable qui est complémentaire à une séquence spécifique d'un gène donné. L'annexe 2 (p. 146) décrit l'utilisation des sondes pour la technique microarray Affymetrix. Sterrad® :

Marque déposée d'un appareil de stérilisation (Advanced Sterilization Products). Le procédé repose sur le pouvoir bactéricide du peroxyde d'hydrogène activé sous forme de plasma froid. Un plasma est une phase de la matière constituée de particules chargées; un gaz plasma est un gaz ionisé.

Temps de diffusion d'une charge électrique :

Dans un milieu donné, temps caractéristique de répartition des charges électriques pour atteindre une position d'équilibre.

Temps de propagation de l'onde électromagnétique :

Dans un milieu donné, temps mis par une onde électromagnétique pour parcourir une distance donnée (ordre de grandeur de la dimension du problème).

Transcriptomique :

Etude de l'ensemble des ARN messagers produits lors du processus de transcription d'un génome.

Transduction :

Mécanisme par lequel une cellule répond à l'information qu'elle reçoit en activant une série de signaux secondaires (internes ou externes à la cellule) ou des processus cellulaires internes (métabolisme, cycle cellulaire, motilité etc...).

Translocation :

Type de transport correspondant à un passage direct des protéines au travers d'une membrane via des pores.

Western blot :

Chap

1.1 H

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1.2 Recommandations de santé publique

L'International Agency for Research on Cancer (IARC), groupe d'experts scientifiques de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), publie une monographie sur l'évaluation des risques carcinogènes pour l'homme des champs électriques d'extrêmement basses fréquences (ELF-EF) et des champs magnétiques d'extrêmement basses fréquences (ELF-MF) [IARC, 2002]. Les ELF-MF ont la particularité de pénétrer à l’intérieur du corps sans être modifiés et d'y induire la circulation de courant [OMS, 1998]. Les ELF-MF ont été classés dans la catégorie "peut être carcinogène pour l'homme" (Groupe 2B) au même titre que le café. Elle correspond à un facteur de risque carcinogène considéré comme limite ou réfutable et dont la preuve n'a pas été établie de manière certaine sur l'animal. Cette conclusion est basée sur des résultats épidémiologiques indiquant que l'exposition aux champs ELF pourrait être une cause de leucémie infantile sans être expliquée par des mécanismes connus ou confirmée expérimentalement. Les ELF-EF ont quant à eux été classés dans le Groupe 3 c'est-à-dire "non classés quant à leurs effets carcinogènes pour l'homme", les preuves étant jugées insuffisantes chez l'homme et insuffisantes ou limitées en expérimentation animale [IARC, 2002].

Le rapport le plus récent émanant d'une commission officielle d'experts a été publié par le Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks (SCENIHR) et concerne les effets potentiels sur la santé de l'exposition aux EMF [SCENIHR, 2015] :

- Le Comité confirme que les nouvelles études épidémiologiques :

▪ sont conformes aux conclusions antérieures indiquant un risque accru de leucémie infantile pour des expositions quotidiennes moyennes supérieures à 0,3-0,4μT;

▪ ne fournissent pas de preuve convaincante d'un risque accru de maladies neurodégénératives, y compris la démence;

▪ concernant la grossesse, ne montrent pas de signes défavorables liés à l'exposition ELF-MF. Les conclusions des études sur la santé de l'enfant suite à l'exposition maternelle durant la grossesse comportent des biais méthodologiques et ne peuvent servir pour l'évaluation du risque;

▪ aucun effet n'a pu être observé concernant la reproduction humaine. - En ce qui concerne les études in vitro les experts constatent que :

▪ la pertinence d'un lien entre l'exposition ELF-MF et la leucémie infantile n'est pas claire et les mécanismes sont toujours inconnus;

▪ les ELF-MF peuvent induire des effets génotoxiques ainsi que d'autres effets biologiques pour des densités de flux magnétique supérieur à 100μT.

champs magnétiques. Avant de donner du poids à ces résultats, il faudra renouveler ces études de manière indépendante.

Bien que les effets biologiques de l'exposition ELF-EMF, -MF ou -EF soient étudiés depuis de très nombreuses années, les conclusions des Commissions Scientifiques montrent une divergence entre études épidémiologiques et études expérimentales ou présentent des conclusions non définitives. Découvrir les mécanismes cellulaires impliqués et activés par la stimulation ELF est une étape indispensable pour comprendre les réactions du corps face à la stimulation ELF. Ces connaissances permettront de mieux définir les effets bénéfiques des ELF ainsi que leur seuil de de risque pour la santé.

Les normes légales d'exposition actuellement en vigueur sont présentées à l'annexe 6 (p. 166).

1.3 Stimulation d'extrêmement basses fréquences : exemples d'application

1.3.1 En orthopédie

En plus des caractéristiques électrophysiologiques classiques des tissus vivants (potentiel de membrane, courant de dépolarisation etc…) des variations de potentiels endogènes ont pu être mesurées, notamment au niveau osseux [Yasuda, 1953; Cochran, 1966; Cowin et al., 1995]. Dès 1953, en observant des variations de potentiels électriques apparaissant à la surface de l'os lors des phases dynamiques de mise en charge, Yasuda a ouvert la voie à l'étude de leurs effets sur l'ostéogenèse [Yasuda, 1953]. Pour cet auteur, les variations de potentiels électriques sont responsables de la formation du cal* lors de la consolidation des fractures. Comme Yasuda et al. [1953], Nogushi [1957] montre que dans certaines conditions, des variations de potentiels électriques appliquées à l'os favorisent la formation de tissu osseux.

Bassett et al. [1964] implantent une anode et une cathode reliées à un générateur de courant continu au travers d'une corticale de fémur de chien in vivo et observent l'apparition d'os autour de la cathode. Pour Bassett [1971], l'os convertit l'énergie mécanique en un signal électrique qui modifie l'environnement des cellules mésenchymateuses* contrôlant leurs activités fonctionnelles et mitotiques. Ces variations font intervenir des amplitudes d'EMF bien inférieures aux potentiels de membrane.

L'application de champs exogènes modifie le métabolisme osseux en accélérant certains processus physiologiques sans entraîner de manifestations pathologiques [Hinsenkamp, 1994; Chang et al., 2003].

La cohérence des résultats de nombreuses études in vivo et in vitro portant sur l'effet des courants électriques sur l'os montrent que l'ostéogenèse peut être stimulée par des variations de potentiel électrique [Hinsenkamp, 1994]. Néanmoins, les mécanismes cellulaires impliqués lors d'une stimulation par un champ électromagnétique ou un courant électrique restent mal connus.

1.3.2 Analyse des mécanismes cellulaires : études antérieures

- une augmentation de la concentration des glycosaminoglycanes* _{acides dans la matrice}

cartilagineuse des rudiments osseux d'embryons de souris in vitro [Hinsenkamp et al., 1982; Rooze et al., 1982; Hinsenkamp, 1994];

- une augmentation significative de la longueur totale des rudiments osseux accompagnée d'une accélération du processus d'ossification primaire sur des tibias et des métatarses d'embryons de poulet in vivo [Rooze et al., 1985; Hinsenkamp, 1994];

- une relation entre l'amplitude du champ électrique local et le taux d'ossification sur des embryons de caille [Hinsenkamp et al., 1985a; Hinsenkamp, 1994].

Les résultats des études in vitro [Hinsenkamp et al., 1982; Rooze et al., 1982; Hinsenkamp, 1994], in vivo [Hinsenkamp et al., 1985a; Rooze et al., 1985; Hinsenkamp, 1994] et cliniques [Hinsenkamp et al., 1984, 1985b, 1993a, 1993b] sont en accord avec une accélération de la différenciation de la matrice cartilagineuse précédant l'ossification.

Les modèles osseux étant complexes à mettre en œuvre, le modèle expérimental a été simplifié. Des cultures d'épiderme humain sur support dermique in vitro ont été utilisées (chap. 4.1 p.39). La conductivité électrique de l'os et de la peau est relativement plus faible que celle des autres tissus (annexe 5.3, p. 163). Le modèle de base de la culture des kératinocytes est inspiré du protocole utilisé par Prunieras et al. [1983].

Lors de l'utilisation d'un courant continu, une première étude [Jercinovic et al., 1996] a montré sur ce modèle de culture que la position des explants sur le support dermique avait une incidence sur leur croissance, le courant continu entraînant une polarisation du milieu et une modification du pH autour de l'anode. Par contre, lors de l'utilisation du signal alternatif [Hinsenkamp et al., 1997] aucune incidence de la position de l'explant n'a été observée.

Les caractéristiques de la stimulation (forme d'onde, intensité et fréquence du signal, fréquence et durée de la stimulation) se basent sur une revue de la littérature publiée par Vodovnik et al. [1992] sur les applications humaines de la stimulation électrique et électromagnétique dans le traitement des plaies chroniques ainsi que sur une étude clinique de la cicatrisation des blessures chroniques [Jercinovic et al., 1994].

Ce modèle de croissance épidermique, stimulé par un courant électrique pulsé asymétrique à charge nulle de 40Hz, modulé par une fréquence de 0,125Hz et transmis par deux électrodes de platine, offre un protocole simplifié et bien caractérisé pour étudier les effets biologiques des ELF. Les résultats sur les cultures stimulées par un courant pulsé à charge nulle montrent [Hinsenkamp et al., 1997] :

- une diminution de la zone de croissance entourant les explants (fig. 1);

Figure 1 : zone de croissance entourant un explant épidermique de 3mm de diamètre. La photo de gauche (A) est l'explant témoin après 12 jours de culture, la photo de droite (B) l'explant après 11 jours de stimulation et 12 jours de culture

- une meilleure stratification avec augmentation du nombre de couches de kératinocytes différenciés;

- une diminution de l'incorporation de la thymidine tritiée reflétant la diminution du nombre de mitoses.

Ces observations suggèrent qu'une stimulation électrique pulsée ELF influence la différenciation des explants de la culture épidermique. Une meilleure structure et maturation des couches épidermiques dans les zones formées autour de l'explant sont également observées. Ce phénomène se fait au dépend de la prolifération : le nombre de mitoses diminue parallèlement à la taille de la zone de croissance voisine de l'explant. Cela confirme l'accélération de la différenciation observée précédemment in vivo et in vitro sur différentes espèces [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994].

1.3.3 Développements actuels

Les résultats obtenus par Hinsenkamp et al. [1997] utilisant un courant électrique pulsé ELF appliqué sur des cultures d'épiderme humain sur supports dermiques dévitalisés in vitro aboutissent à la même conclusion que les études des effets des EMF sur le tissu osseux [Hinsenkamp et al., 1982, 1985a; Rooze et al., 1982, 1985; Hinsenkamp, 1994] où une maturation plus rapide de la matrice cartilagineuse associée à une accélération de l'ossification des modèles de tissus embryonnaires ont été observées.

Compte tenu de la réponse cohérente obtenue sur ces modèles biologiques suite à l'application d'un courant électrique ou électromagnétique pulsé, asymétrique, à charge nulle, de basses fréquences et de faible amplitude, nous proposons de rechercher les mécanismes impliqués au niveau cellulaire par screening de l'expression génique.

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un grand nombre de protéines dont plusieurs facteurs de transcription pour activer l'expression des gènes et initier la réponse cellulaire [Cursons et al., 2015].

Squarize et al. [2010] ont observé que l'activation de la voie PI3K-Akt-mTOR fait partie du

processus normal de réparation du tissu cutané. Ils ont montré que l'activation de la voie

Figure 3 : voie de signalisation PI3K-Akt

Source : Biocarta : http://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/h_aktPathway

La voie de signalisation Wnt (fig. 5) joue un rôle important dans l'organogenèse et la

morphogenèse de la peau [Widelitz, 2008]. En l'absence de Wnt, la voie de signalisation du

même nom est inhibée et le niveau de β-caténine est maintenu bas par un complexe multi-protéines cytoplasmique comprenant les protéines Axine, Adenomatous Polyposis Coli Protein (APC) et glycogène synthase kinase 3 (GSK3). APC et Axine participent à la phosphorylation de la β-caténine par GSK3 qui est ensuite ubiquitinylée et dégradée par un protéasome. L'effet de cette régulation négative de Wnt est une réduction de la prolifération

cellulaire [Pasca di Magliano et al., 2007] et une induction de la différenciation cellulaire terminale [Boyden et al., 2002; van der Horst et al., 2005]. DKK1 joue un rôle dans la

régulation négative de cette voie de signalisation [van der Horst et al., 2005]. Une voie de signalisation Wnt active nécessite une translocation* de l'axine et de ses protéines associées à travers la membrane cellulaire [Chen et al., 2006], cette translocation est impossible sans la présence de MACF1.

Quant à FOXO1, il joue un rôle important dans la transformation des kératinocytes vers un

phénotype de cicatrisation. Il active la migration et la sur-expression de la transforming growth

Figure 4 : voie de signalisation Akt-mTOR, Source : Biocarta : http://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/h_mTORPathway

Figure 5 : voie de signalisation Wnt

Source : Biocarta :

2.3 Etudes expérimentales

2.3.1 Expression des gènes et des protéines

En 2005, le "World Health Organization’s EMF Project", "l'European Union’s Cost 281 Action", la "Commission K of the International Union of Radioscience", le "Forschungsgemeinschaft Funk", le "VerUm Foundation" et "l'International Committee on Electromagnetic Safety from USA" ont organisé le premier atelier sur la transcriptomique* et la protéomique* dans la recherche sur les EMF. Suite à ce workshop, Leszczynski [2006] conclut dans son Editorial de la revue Proteomics, que l'utilisation des techniques protéomiques et transcriptomiques est une approche utile pour déterminer les cibles moléculaires possibles des EMF au niveau subcellulaire. Il ajoute que ce type de recherche systématique peut générer une importante base de données qui permettrait aux scientifiques de formuler des hypothèses plus précises concernant les mécanismes des effets biologiques des champs électromagnétiques. En 2012, dans le cadre de l'action COST BM0704, il publie avec d'autres spécialistes une revue de la littérature (2005-2010) sur l'utilisation de ces techniques [Leszczynski et al. 2012]. La conclusion précise qu'aucun résultat convaincant ne révèle d'effet nocif des EMF. Ils indiquent toutefois que la majorité des études examinent les effets aigus. Les modèles biologiques étudiés ont été exposés à une dose unique avant extraction de la protéine ou de l'analyse de l'expression des gènes. La réalité de l'exposition des populations humaines est souvent très différente puisqu'elles sont exposées chroniquement aux ELF durant de nombreuses années. Ils notent qu'à partir des études menées, il est impossible de trouver un gène, un groupe de gènes ou des protéines pouvant être considérés comme marqueurs d'une réponse cellulaire à la stimulation EMF. Ils considèrent que les recherches utilisant la protéomique ou la transcriptomique devraient se poursuivre sur des modèles humains : les expérimentations pourraient fournir ainsi des résultats directement applicables dans l'évaluation des risques sur la santé humaine. Les études animales, nécessaires pour identifier des mécanismes, ne peuvent fournir aucune preuve fiable relative à d'éventuelles conséquences cliniques. Les lignées cellulaires immortalisées devraient être proscrites, les voies de la régulation cellulaire étant modifiées et non physiologique. Ils expliquent l'importance de réaliser des études utilisant différentes approches analytiques validées par leur reproduction systématique et que les changements observés doivent être confirmés par d'autres techniques ARN (qRT-PCR*).

Les publications (2008-2015) résumées ci-dessous utilisent une stimulation ELF et analysent l'expression des gènes et des protéines (tab. 1, p. 16). La plupart des études analysent un petit nombre de gènes ou de protéines, seules deux publications [Jennings et al., 2008; Caputo et al., 2014] (1‡, 2) réalisent un screening complet de l'expression des gènes par microarray sur un modèle de lignée cellulaire humaine stimulé par des EF. Les recherches de Sun et al. [2010] (22), Bouwens et al. [2012] (23), Chen et al. [2012] (25), Huwiler et al. [2012] (26), Kirschenlohr et al. [2012] (24) ne montrent aucun effet sur les gènes étudiés. Lisachev et al. [2010] (17) ne révèlent pas d'effet pour la stimulation à 4,4Hz alors que la stimulation à 100Hz modifie l'expression de certains gènes. Les autres publications réalisant un screening microarray présentent toutes une modification de l'expression de certains gènes étudiés [Chung et al., 2010;

Jennings et al., 2008; Caputo et al., 2014] (15, 1, 2), excepté pour une étude sur la levure [Chen et al., 2012] (25) et les bactéries [Huwiler et al., 2012] (26). Quatre équipes [Tsai et al., 2009; Jansen et al., 2010; Wang et al., 2011a; Zhou et al., 2012] (3, 4, 5, 6) ont analysé par PCR l'expression de gènes après une stimulation PEMF sur 3 lignées cellulaires humaines et un modèle de rat. Pour la stimulation EMF, Vianale et al. [2008] (7), Mayer-Wagner et al. [2011] (8), Wang et al. [2013] (10) et Corallo et al. [2014] (11) ont travaillé sur des lignées cellulaires humaines et Selmaoui et al. [2011] (9) sur des échantillons de sang humain avec des analyses ciblées utilisant les PCR, ELISA ou la protéomique. Ces techniques ciblées ont également été utilisées sur des modèles de rats et de souris [Aydin-Abidin et al., 2008; Hu et al., 2008; George et al., 2008; Chung et al., 2010; Cuccurazzu et al., 2010; Lisachev et al., 2010; Reyes-Guerrero et al., 2010; Rodríguez - De la Fuente et al., 2012] (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), sur des insectes [Li et al., 2013a] (20) et sur des champignons [Potenza et al., 2012] (21). Ces études présentent toutes une modification de l'expression des gènes étudiés.

2.3.2 Modification du développement cellulaire

2.3.2.1 Prolifération

Les résultats obtenus sur la prolifération cellulaire sont variables. Les études ont été menées sur différents modèles de cultures (cellules humaines, muridées, bovines et porcines) et suivant les protocoles, les résultats montrent une augmentation, une diminution ou une absence d'effet sur la prolifération. Ces résultats varient ou s'inversent en présence de co-facteurs (tab. 2, p. 22).

Un effet fenêtre (chap. 2.3.5, p. 13) est observé sur la prolifération des fibroblastes [Binhi et al., 2000]. Liu et al. [2013] soutiennent cette hypothèse en montrant une prolifération accrue pour une stimulation de 10Hz mais aucune différence significative pour les groupes de stimulation à 30Hz ou 50Hz.

2.3.2.2 Différenciation

Löschinger et al. [1998], travaillant sur des cultures de fibroblastes humains stimulés à 20Hz, observent une induction de la différenciation terminale après stimulation de 12 heures/jour durant 14 jours. Lisi et al. [2006] constatent qu'une exposition (1h, 2 fois/jour) de kératinocytes normaux à un champ de 7Hz - 100μT EMF augmente la différenciation cellulaire. Manni et al. [2004] ont travaillé sur des cellules primaires de kératinocytes humains buccaux exposés à un champ électromagnétique (50Hz); leurs résultats supportent l'hypothèse que l'exposition aux EMF induit un niveau de différenciation plus élevé.

de l'ostéocalcine et la production de collagène. Le traitement avec des PEMF aboutit à un phénotype ostéoblastique mieux différencié et plus mature.

Dans leurs expériences, Cho et al. [2012], Kim et al. [2013], Choi et al. [2014], observent une différenciation neuronale accrue par un traitement à 50Hz ELF.

2.3.3 Accélération d'un processus physiologique

Pour Callaghan et al. [2008] et Goudarzi et al. [2010] la stimulation PEMF accélère la cicatrisation des plaies des patients normaux ou diabétiques et protège de la nécrose tissulaire. Patruno et al. [2010] observent que la stimulation ELF-EMF 50Hz accélère la cicatrisation des plaies cutanées avec transition plus rapide de la phase inflammatoire vers la différenciation terminale. Une revue de la littérature [Pesce et al., 2013] sur la cicatrisation des plaies confirme cette observation.

Comme indiqué dans le chapitre précédent, suite à l'exposition ELF-PEMF la différenciation des chondrocytes est plus rapide [Ciombor et al., 2002]. Les résultats de Cuppen et al. [2007] indiquent que la stimulation ELF-EMF améliore la compétence immunitaire des animaux. Sun et al., [2009] montrent que la prolifération débute plus rapidement dans le groupe stimulé que dans le groupe témoin.

2.3.4 Génotoxicité

Vijayalaxmi et al. [2005] observent que 46% des 63 publications recensées ne révèlent aucune augmentation de dommage du matériel génétique, 22% suggèrent une augmentation et 32% sont non concluantes. En 2009, ils analysent 87 publications (1990-2007) et concluent que si les études sont menées sous le seuil de sécurité recommandé par les directives de l'International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection [ICNIRP, 1998] ou du National Radiological Protection Board [NRPB, 2001], les indices de génotoxicité globaux de la méta-analyse (exposition ELF versus témoins) sont similaires à l'indice "spontané" à partir d'une base de données historiques sur les cellules normales [Vijayalaxmi et al., 2009].

Maes et al. [2012] revoient la littérature dans le but de préciser l'intérêt de la cytogénétique pour évaluer une éventuelle relation entre ELF-MF et maladie d'Alzheimer. Leur conclusion indique qu'il est généralement admis que les ELF-MF ne sont pas des agents génotoxiques, mais certaines publications indiquent qu'ils peuvent augmenter les effets d'agents connus pour induire des mutations ou des tumeurs. Trente et une références (1991-2009) sont répertoriées dont trois synthèses qui montrent l'absence d'effet génotoxique dans la majorité des études. Des exceptions existent, certaines données suggérant une induction de l'instabilité chromosomique due à l'exposition aux EMF.

Yokus et al. [2008] exposent des rats durant 10 mois à un champ de 50Hz-100μT, 2 heures/jour. Ils obtiennent une modification significative par oxydation des bases ADN alors qu'aucune modification n'est observée avec une exposition de 500μT. Kim et al. [2010] comparent une exposition unique de 60Hz - 6mT MF, 30min à une exposition répétée. Pour l'exposition unique, ils ne constatent pas de variation de viabilité des cellules mais une augmentation des cassures de l'ADN double-brin tant dans les cultures de cellules normales que cancéreuses. Pour une exposition répétitive, ils observent une réduction de la viabilité cellulaire et une augmentation des cassures de l'ADN double-brin dans toutes les cellules. Dans une étude sur des embryons de souris exposées à des ELF-EMF, Borhani et al. [2011] observent que l'exposition au stade préimplantatoire aurait des effets néfastes sur l'embryon en augmentant la fragmentation de son ADN. Mariucci et al. [2010] étudient le dommage de l'ADN cérébral et détectent des atteintes avec un effet réversible dans toutes les zones exposées. Lors d'une stimulation MF de 2,5mT durant 96h sur la souche Saccharomyces cerevisiae, Ruiz-Gómez et al. [2010] observent une déficience dans la réparation des brins d'ADN ainsi qu'une altération de la croissance et de la survie mais aucune altération de l'ADN ou du cycle cellulaire. L'équipe de Wilson [2015] recherche des mutations dans les tissus somatiques et germinaux de souris mâles exposées à un MF de 10, 100 or 300μT à 50Hz durant 2 ou 15h. Leurs résultats suggèrent que, pour les doses utilisées, les effets mutagènes in vivo des ELF-MF sont mineurs voir négligeables.

Bułdak et al. [2012] ont combiné du cisplatine, inducteur de réponse oxydative et une stimulation ELF-MF. La stimulation a atténué les effets du stress oxydatif et les dommages de l'ADN causés par le cisplatine alors que la stimulation ELF-MF seule présente un stress oxydatif léger et est inducteur de dommages à l'ADN. Markkanen et al. [2008] observent qu'un prétraitement MF à 100μT diminuait la génotoxicité cellulaire de la ménadione, un agent génotoxique. Ils ne trouvent par contre aucun effet pour : la stimulation MF seule, la combinaison MF et ultraviolet-B, la stimulation MF après exposition à la ménadione. En 2011, la même équipe [Luukkonen et al., 2011] confirme les résultats de 2008 sur l'effet de la ménadione après un prétraitement 100μT MF. L'équipe de Mizuno [2014] n'a trouvé aucun changement important sur la survie des cellules ou le dégât de l'ADN lorsque des cellules sont exposées aux rayons ultraviolets-B suivi par une stimulation EMF 5mT.

2.3.5 Effet fenêtre

Bawin et al. [1976] considèrent que la réponse des cellules aux EMF dépend de fréquences spécifiques et proposent l'existence d'un "effet fenêtre". Il existerait pour les signaux des "fenêtres" d'intensités et de fréquences dans lesquelles apparaîtrait une réaction biologique [Adey, 1996]. La délimitation des "fenêtres" restant floue les conclusions sont susceptibles d'évoluer. Robison et al. [2002], Heredia-Rojas et al. [2001] semblent confirmer l'approche de Bawin montrant la non-linéarité des effets en fonction de l'évolution des champs sur des études traitant de prolifération cellulaire ou de cancer.