Protocole et résultats des études cinétiques.

Le sang est composé à 55% de plasma contenant des protéines plasmatiques (Fig. III.4.) dont le rôle est de transporter des substances dans l’organisme telles que les molécules alimentaires (glucose, lipides, …), et les déchets du métabolisme (urée, …). C’est aussi le plasma qui va transporter dans l’organisme les radiopharmaceutiques injectés au patient. C’est pour cette raison que des études de stabilité in vitro en plasma murin précèdent en règle générale toute étude in vivo afin d’évaluer la résistance du complexe en milieu circulant.

Cette étude consiste en l’incubation à 37°C d’un volume de plasma murin contenant le complexe étudié à haute dilution, reproduisant les conditions in vivo. A intervalles de temps réguliers, un aliquot est prélevé et sa composition est analysée par radio-HPLC. Afin d’être injecté en HPLC, il est indispensable de se débarasser préalablement des protéines de grande taille présentes dans le plasma. Il existe plusieurs techniques permettant de précipiter ces

139 protéines. Les deux plus courantes sont la précipitation par ajout d’un solvant miscible à l’eau : méthanol, éthanol, isopropanol, ou acétonitrile [29-31], et la précipitation par acidification : acide trifluoroacétique (TFA), acide trichloroacétique (TCA), acide dicholoroacétique (DCA) [32]. La technique utilisée jusqu’à présent au laboratoire consistait à précipiter les protéines au méthanol [21]. Cette méthode présente cependant un inconvénient majeur : la présence du méthanol entraine la majeure partie du produit dans le pic d’injection lors d’une étude par HPLC. La solution pour s’affranchir de ce problème consiste à diluer fortement l’échantillon dans l’eau, mais elle introduit un biais dans la mesure lié à une baisse de résolution des radiochromatogrammes. Nous nous sommes donc tournés vers une méthode de précipitation par acidification au moyen d’une solution de TFA (10%).

Afin de nous assurer que la méthode de précipitation employée n’avait aucun effet sur les complexes étudiés, et en particulier qu’aucune dissociation des complexes n’avait lieu, nous avons effectué une étude de stabilité dans les conditions de précipitation en l’absence de plasma (remplacé par un volume équivalent d’eau). Les radiochromatogrammes indiqués à la figure III.8. ont ainsi été obtenus avec le composé 99mTc-1.

Fig. III.8. : Stabilité de 99mTc-1 en milieu acide dans les conditions de précipitations des protéines plasmatiques.

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On constate qu’après 2h, les échantillons prélevés ne contiennent aucun produit de dégradation, le complexe est toujours présent et intact (Fig. III.8.). L’emploi de cette méthode de précipitation a donc été validée. Une fois les protéines précipitées, le surnageant est légèrement dilué de façon à réduire la proportion d’acide, puis étudié par radio-HPLC.

Les études cinétiques réalisées sur les deux composés et deux références ont été réalisées en utilisant du plasma murin frais de souris Balb-C obtenu par centrifugation de prélèvements sanguins. Une solution fraichement préparée de complexe (nanomolaire) est ajoutée au plasma (complexe/plasma 1/9) et incubée à 37°C pendant 6h. A intervalles de temps réguliers, un échantillon de la solution est prélevé et les protéines sont séparées par précipitation et centrifugation. L’échantillon est alors analysé par radio-HPLC. La figure III.9. montre l’allure des chromatogrammes obtenus, ici dans le cas de 99mTc-1 en tenant compte de la décroissance du technétium entre les deux injections.

Fig. III.9. : Radiochromatogrammes de 99m_{Tc-1 après incubation en plasma murin à 37°C.}

La proportion de technétium résiduel dans l’échantillon peut alors être évaluée en mesurant le rapport de l’aire correspondant au complexe à l’instant t = 2 h et de cette même aire à t = 0 min. Dans le cas de la figure III.9., la valeur de ce rapport est de 0.9. Cela signifie

141 que seuls 90% de l’activité a été retrouvée deux heures après le mélange dans un échantillon prélevé et étudié de la même façon. Ces radiochromatogrammes permettent également de suivre l’apparition d’éventuels produits de dégradation caractérisés par des pics nouveaux.

Toutes ces mesures permettent de tracer les courbes reflétant l’évolution en fonction du temps d’incubation à 37°C du pourcentage de complexe résiduel dans les échantillons prélevés (fig. III.10.).

Fig. III.10. : Cinétiques de dégradation en plasma murin (concentration nanomolaire, 37°C, 6h) des complexes présélectionnés (99mTc-1 :

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La première indication donnée par ces courbes est que chacun des complexes étudiés présente une stabilité supérieure à 60% après 6h d’incubation en plasma murin à 37°C.

Le complexe référence 99mTc-13, obtenu à partir du ligand N2S2 est plus stable que son

homologue 99mTc-14 obtenu à partir du ligand N3S (90% contre 63%). Cette différence de

stabilité entre complexes Tc-N2S2 et Tc-N3S a déjà été décrite dans la littérature [20] et

s’explique par un recouvrement particulièrement favorable des orbitales d du métal et p du souffre dans les complexes à géométrie pyramidale à base carrée.

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Le complexe 99mTc-11 présente une stabilité d’environ 60% à 6h. Cette stabilité reste intéressante mais bien inférieure à celle observé pour 99mTc-1 et comparable au résultat obtenu avec la référence N3S. On peut donc penser que la présence d’un seul thiol chélatant

explique cette diminution de stabilité. Dans la suite de cette étude nous porterons uniquement notre attention sur le complexe 99mTc-1.

Ainsi le complexe 99mTc-1 donne des résultats très encourageants puisque l’on observe plus de 90% de complexe résiduel après 6h d’incubation. Compte tenu des difficultés techniques inhérentes à la mesure effectuée à t = 0 min et de l’allure de pallier observée par la suite, on peut penser que cette variation soudaine dans la première demi-heure d’incubation est le résultat d’un artefact lié à l’expérience. Cette analyse est d’autant plus légitime que les radiochromatogrammes obtenus lors de l’étude cinétique n’indiquent aucune formation de produit de dégradation (fig. III.6.), toute l’activité mesurée dans le surnageant correspondant au complexe.