Dans le procédé de revêtement par immersions successives présenté dans le Chapitre II, une partie du calcium prése t da s le se o d ai d i e sio peut t e e pla pa l age t antibactérien sous forme cationique, comme décrit sur la Figure V-1.
Figure V-1 : Schéma du principe de dopage en élément antibactérien dans le procédé de revêtement par immersions successives
Bain de phosphate Centrifugation Bain de calcium
+ Agent antibactérien
Rinçage Séchage
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Plusieurs problèmes expérimentaux ont été rencontrés ici.
Pre i e e t, lo s de l ajout du KOH da s la solutio de al iu o te a t l age t antibactérien afin d aug e te le pH à u e aleu de , u p ipit se fo e. E effet, les age ts a ti a t ie s fo e t, e p se e d io s OH-,des hydroxydes tels que Cu(OH)
2, Zn(OH)2 et AgOH
identifiés par DRX (résultats non présentés). Ces derniers sont très peu solu les da s l eau a leu s produits de solubilité Ks sont égaux à 2 10-19, 5 10-17 et 2 10-8 respectivement [194], [195].
Aussi, l ajout d io s a ge t da s la solutio atio i ue e à la fo atio d u p ipit ide tifi o e de l AgCl pa D‘X sultat o p se t a l a ge t agit a e les io s hlo u e p o e a t du sel de calcium utilisé dans le bain (CaCl2,4H2O et la solu ilit de l AgCl est t s fai le Ks = , -10
[194]).
Enfin, comme précisé dans le Chapitre II, une géométrie différente appelée pion a été utilisée afin de produire les échantillons pour les essais biologiques, nécessitant une surface circulaire et plane, alors que la mise au point du p o d d i e sio s su essi es a t alis e su des su st ats de t pe i pla ts et ales. Ce ha ge e t de g o t ie a e t ai l o se atio de revêtement inhomogène et non couvrant.
Toutes ces observations nous ont alors amené à modifier le protocole du procédé de revêtement précédemment développé.
Afin de résoudre les deux premières problématiques présentées précédemment, le sel utilisé comme source de calcium (CaCl2, 4H2O) a été remplacé par du nitrate de calcium (Ca(NO3)2, 4H2O)
car les ions antibactériens se présentent également sous la forme de nitrate et sont très solubles da s l eau.
Cela pe et alo s d ite la fo atio d AgCl. La solutio de KOH utilisée pour ajuster le pH de la solutio atio i ue a t e pla e pa de l a o ia ue pe etta t ai si d aug e te le pH du ai de al iu sa s i t odui e d io s OH- fa o isa t la fo atio d h d o des peu solu les.
Cepe da t, ela a pas t o lua t a l a o ia ue s apo ait lo s du hauffage à °C e dans un pot fermé hermétiquement et des précipités apparaissaient. De plus, cet ajout d a o ia ue diluait la solutio de al iu .
Des essais ont alors été réalisés sans basification du bain de calcium, initialement à pH = 4,5. Les spectres Raman et FTIR de deux revêtements obtenus dans ces conditions (ech 1 et ech 2) ainsi u u spe t e asso i au e te e t de f e e e h ef o e d elopp da s le Chapitre III sont présentés sur la Figure V-2 et la Figure V-3. L ha tillo p se te des a des ide ti ues à l ha tillo de f e e o espo da t au g oupe e ts phosphates e t e 1180 et 925 cm-1 par
spectroscopie FTIR (Figure V-3. De plus, la p se e d u e phase apatiti ue da s e e te e t, similaire à la référence, est validée par la spectroscopie Raman grâce à la présence de la bande à 962
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cm-1 o espo da t au ode de i atio 1 des PO4 de l apatite ai si ue elle à 3571 cm-1
correspondant à la vibration des OH apatitique (Figure V-2). Il est donc possible de conclure que le revêtement est toujours composé de ns-HAP et ce malgré le fait que le pH du bain de calcium soit légère e t a ide. Ce i peut p o e i du fait ue la solutio d io s phosphate esta t e su fa e de l ha tillo lo s de l i e sio de elui-ci dans le bain de calcium contient majoritairement des ions phosphates sous la forme HPO42- et PO43- car le bain de phosphate est à pH = 12,7.
Néanmoins, les spectres Raman et FTIR des revêtements obtenus présentent des bandes qui e o espo de t pas au phosphates de al iu . L ha tillo présente en effet des bandes à 724, 1066 et 1384 cm-1 sur le spectre Raman correspondant au nitrate de sodium (Figure V-2). Ce
résultat est également confirmé par spectroscopie FTIR avec les pics à 1790, 1450 1338 et 834 cm-1 attribués à ce même composé (Figure V-3). Les spectres Raman et FTIR indiquent quant à eux la p se e de it ate de al iu su l ha tillo a e la p se e d u e a de à -1 sur le
spectre Raman (Figure V-2) et à 1419, 1312 et 817 cm-1su le spe t e FTI‘ de l ha tillo Figure
V-3). Ces it ates de al iu et de sodiu p o ie e t, d u e pa t, du sel utilis do a a t o e source de calcium pour la synthèse (Ca(NO3)2,4H2O et, d autre part, de la recombinaison des ions
Na+ provenant de la source de phosphate (Na
3PO4, 12H2O) avec les ions nitrates (NO3-). Un nouveau
p oto ole de la age des ha tillo s à la fi du p o d d i e sio s su essi es a alo s dû t e is au point et sera dis ut pa la suite d s lo s u u p oto ole pe etta t l o te tio d u e te e t répétable sera établi.
Figure V-2 : Spe t es Ra a d'u ev te e t de f e e, de deu ev te e ts o te us lo s de l’utilisation de nitrate de calcium et des sels de référence de nitrates de sodium et calcium
NaNO3
Ca(NO3)2, 4H2O
Ech 2 Ech 1 Ech ref
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Figure V-3 : Spectres FTIR-ATR d'u ev te e t de f e e, de deu ev te e ts o te us lo s de l’utilisatio de nitrate de calcium et des sels de référence de nitrates de sodium et calcium
Afi de soud e la p o l ati ue li e à l o se atio de e te e ts i ho og es et on couvrants sur les pions, l tape de e t ifugatio a e o e u e fois t tudi e à l i age de ce qui a été décrit dans le Chapitre III da s le ut d o te i u e te e t su pio se la le à elui développé sur implants et cales. En ce sens, les paramètres de centrifugation (temps et vitesse) ainsi u u ou eau suppo t o t t tudi s. E effet, la su fa e utile du pio est pas e pos e de la même manière que celle des cales lors de la centrifugation résultant en un déplacement différent du liquide présent à la surface de ces échantillons. Cela est illustré par la Figure V-4. Pour pallier cela, un nouveau support a été conçu et fabriqué permettant une orientation perpendiculaire des pions par rapport au support classique (Figure V-5).
Ech ref Ech 1 Ca(NO3)2,4H2O Ech 2 A bs or ba nc e (U .A .) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 No e d o de -1) NaNO3
a)
Ech ref Ech 1 Ca(NO3)2,4H2O Ech 2 NaNO3 A bs or ba nc e (U .A .) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 No e d o de -1)b)
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Figure V-4 : Schéma représentant la différence de déplacement du liquide à la surface des cales ou des pions en fonction du support utilisé lors de la centrifugation
Pion Cale
Surface utile
Support classique - cales
Centrifugation
Axe de centrifugation
Force centrifuge
Déplacement du liquide
Support classique - pions Axe de centrifugation
Force centrifuge
Déplacement du liquide
Nouveau support - pions Axe de centrifugation
Force centrifuge
Déplacement du liquide Centrifugation
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Figure V-5 : Photographies du nouveau support (à gauche) et du support classique (à droite) utilisés lors de la centrifugation des pions
Différentes combinaisons de durée (5, 7 et 10 minutes) et de vitesse de centrifugation (500, 700, 1000 et 1500 rpm) ont ensuite été testées avec les différents supports décrits précédemment et les revêtements formés ont été observés au MEB. Les résultats obtenus avec le support classique et le nouveau support sont présentés dans le Tableau V-1. Les paramètres ne permettant pas la fo atio d u e te e t, ep se t pa la Figure V-6a sont identifiés par des croix rouges dans le Tableau V-1. Ces paramètres ont donc été écartés. Les paramètres pour lesquels un revêtement non couvrant est observé, comme représenté par la Figure V-6b où une partie du substrat de titane est visible, sont représentés par des dièses oranges. Enfin, les revêtements couvrants comme celui présenté à la Figure V-6c correspondent aux points verts dans ce même tableau. Pour les conditions de synthèse menant à des revêtements couvrants, une étude de répétabilité a été menée et les résultats sont présentés en pourcentage également dans le Tableau V-1. Cette valeur représente la f ue e à la uelle tous les ha tillo s d u lot u lot o espo d au ha tillo s d u e e s th se, est-à-dire 4 pions à revêtir) sont revêtus.
Tableau V-1: Etude pa a t i ue de l’ tape de e t ifugatio da s le p o d pa i e sio s su essives su les pions avec le support classique et le nouveau support. Présence, homogénéité et répétabilité (indiquée en %) du revêtement sur le substrat en titane en fonction des paramètres de centrifugation (temps et vitesse de rotation : ● = ev te e t recouvrant entièrement la surface; # = revêtement ne recouvrant pas complètement la surface ; X = pas de revêtement ;
case vide : paramètres non testés
Support classique RPM Temps (min) 500 700 1000 1500 5 # # ● % X 7 # # ● % 10 ● % ● % # Nouveau support RPM Temps (min) 500 700 1000 1500 5 # X X # 7 # # # 10 ● % ● % #
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Figure V-6 : Mi og aphies MEB a d’u e su fa e o ev tue ; d’u ev te e t o ouv a t; d’u ev te e t homogène et couvrant
Il est alors possible de noter que le nouveau support conduit à des résultats généralement oi s satisfaisa ts ue le suppo t lassi ue. E effet, deu o i aiso s pe ette t d o te i u revêtement couvrant avec ce nouveau support contre quatre avec le support classique. Ce nouveau support a donc été écarté.
Pour le support classique, les paramètres de centrifugation conduisant à un revêtement ou a t et p ta le %) sont les suivants : 10 min à 700 rpm et 7 et 10 minutes à 1000 rpm.
La micrographie MEB présentée sur la Figure V-7a rappelle la morphologie du revêtement obtenu sur u e ale suite à l opti isatio du p oto ole du p o d pa i e sio s su essi es d it dans le Chapitre III. Il est alo s possi le d o se e ue le e te e t o te u a e u e itesse de centrifugation de 700 rpm et un temps de 10 minutes (Figure V-7b) a la morphologie la plus proche du revêtement de référence (sur cale) alors que la rugosité est encore très visible pour les deux revêtements obtenus avec une vitesse de centrifugation de 1000 rpm (Figure V-7c et d), pouvant laisse suppose ue le e te e t est plus fi . C est la aiso pou la uelle le hoi des pa a t es de e t ifugatio s est po t su le ouple p / i utes lo s ue le procédé par immersions su essi es doit t e alis su des pio s pou la p odu tio d ha tillo s pou les essais
2 µm
a)
b)
2 µm
c)
2 µm
CaP
Ti
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biologiques. Ces paramètres ont donc été utilisés afin de mettre en place le revêtement antibactérien dans la suite de ce travail.
Figure V-7 : Mi og aphies MEB : a Rev te e t de f e e o te u su ale d’ap s le p oto ole ta li da s le hapit e III ; b) Revêtement sur pion avec les paramètres 700 rpm, 10 min ; c) Revêtement sur pion avec les paramètres 1000 rpm,
5 min et d) Revêtement sur pion avec les paramètres 1000 rpm, 7 min
A la suite de l o te tio d u e te e t ep odu ti le, u ou eau p oto ole de la age a dû t e is e pla e à la suite de l ide tifi atio de it ates de calcium et de sodium présents dans le revêtement, comme présenté précédemment (Figure V-3 et Figure V-2). Pour cela différents essais ont été menés sur le nombre de bains de la age alis s, le te ps d i e sio s da s es ai s ai si ue l agitatio de es de ie s. Le Tableau V-2 rassemble tous les protocoles testés. Dans le protocole initial (Protocole 0), les échantillons sont lavés 1 min avec une forte agitation, puis 60 min sans agitation. Le problème de cette immersion pendant un temps long est que le revêtement pou ait se dissoud e et u u e pa tie des io s a ti a t ie s ue l o souhaite i o po e da s le revêtement pourrait être libérée dans la solution de lavage et ne plus être associée au revêtement une fois séché. Pour pallier ce problème, nous avons donc multiplié les bains et allongé les durées d i e sio p og essi e e t e e d passa t pas i utes de temps total d i e sio (Protocoles 1 à 4. Nous a o s ot au u e a lio atio sig ifi ati e : en effet, des nitrates ont été d te t s su au oi s % des ha tillo s d u lot et le la age est o -répétable entre les lots. Les nitrates de calcium et de sodium devraient pourtant se dissoudre facilement car leur solubilité est
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assez le e da s l eau à sa oi et g a es pou g a es d eau espe ti e e t [196]. De plus, nous avons réalisé des revêtements de nitrates de calcium ou de sodium en immergeant les échantillons dans des bains contenant ces espèces dissoutes, en les centrifugeant et en les laissant sécher. Nous avons pu voir que trois bains de lavage de 1 minute sous une agitation de 120 rpm pe ettaie t de dissoud e les e te e ts de it ate de sodiu ou de al iu lo s u ils e so t pas asso i s au e te e t de CaP. L h poth se a a e est ue les it ates so t pi g s da s le revêtement de CaP ou entre le substrat et le revêtement et ue l eau a do du al à les li i e pa dissolution par immersion.
Tableau V-2 : Résumé des protocoles de lavage testés
Protocole 0 Protocole 1 Protocole 2 Protocole 3 Protocole 4 Protocole 5
0 rpm 1 x 60 min 1x 30 min
120 rpm 1 x 30 min
600 rpm 1 x 1 min 3 x 1 min 3 x 5 min 3 x 10 min 3 x 30 s'
Ces i p oto oles a a t pas t o lua ts, u la age à l eau ou a te déminéralisée a alors été mis en place. Celui- i, d u e du e de i , se fait a e les pio s o ie t s e s le as afi ue l eau uisselle su les ha tillo s et a i e do pas le e te e t. Cette thode pe et d li i e les it ates ais est pas t s p ta le a u ha tillo est g alement contaminé alo s ue les aut es e le so t pas au sei d u e lot. De plus, ette te h i ue e peut pas t e i pl e t e da s l e t ep ise. U e tude o pl e tai e de a alo s t e e e ua t au protocole de lavage des échantillons de type pions e tus pa le p o d d i e sio s su essi es.