Les protéines de Pyrococcus abyssi

V.1.1. Expérience de pull-down

La technique de pull-down est utilisée pour rechercher un partenaire d’une protéine d’intérêt avec à partir par exemple d’un extrait cellulaire total ou d’une solution de protéines purifiées. Lorsque l’expérience se fait à partir d’un extrait cellulaire, il faut que le ou les partenaires soient en quantité suffisante pour être détectés et analysés.

Le principe de la technique de pull-down consiste à fixer la protéine d’intérêt sur une colonne ou sur des billes, puis faire passer un extrait cellulaire (sur la colonne ou les billes) afin de piéger les partenaires de cette protéine.

Tout d’abord il faut préparer un extrait cellulaire de Pyrococcus abyssi afin d’isoler les protéines solubles contenues dans l’archaea. Parmi ces protéines il y a en a une ou plusieurs qui peuvent être les partenaires de PAB0955. Les cellules en culture de Pyrococcus abyssi sont cassées afin de libérer les protéines solubles contenues dans les cellules. Les protéines issues de cet extrait cellulaire ne contiennent pas de protéines membranaires.

Puis il faut préparer la protéine d’intérêt. La protéine PAB0955 recombinante contenant une étiquette 6 histidines en Nter ceci permet son accroche sur des billes magnétiques contenant du

Cobalt. La protéine est incubée 20 minutes à 25°C avec ces billes, puis lavée 3 fois afin d’éviter les interactions non-spécifiques.

Les billes ainsi couplées à PAB0955 sont incubées avec un extrait cellulaire de Pyrococcus abyssi pendant 2 heures à 4°C. Après plusieurs lavages des billes, les protéines sont éluées par un tampon Tris à pH 8.8 à 1 M, 2% SDS, 5% !-mercaptoéthanol, 8% sucrose et 0.1 % de bleu de bromophénol. Cet éluât protéique est ensuite séparé par électrophorèse sur gel d’acrylamide en condition dénaturante. Les différentes bandes issues de l’éluât sont ensuite analysées par spectrométrie de masse. Seules deux protéines ont pu être identifiées : la sous unité B de la topoisomérase VI et la protéine DnaG, d’autres partenaires potentiels sont visibles sur le gel (fig.V.1.) mais n’ont pu être analysés par spectrométrie de masse.

V.1.2. Résonance de plasmon de surface

La topoisomérase VI de Sulfolobus shibatae étant disponible à l’IFREMER de Brest, et présentant 35% d’identité avec celle de Pyrococcus abyssi, son interaction avec PAB0955 a été testée par résonance de plasmon de surface (SPR). La protéine PAB0955 recombinante est immobilisée sur la membrane de la SPR et une solution contenant la topoisomérase VI passe sur cette membrane. La topoisomérase VI est un hétérotrétramère de deux sous-unités A et deux sous-unités B. L’interaction entre le topoisomérase VI et PAB0955 est confirmée par

1 2 3

Topo6B DnaG

PAB0955

Figure.V.1. Gel d’électrophorèse à 12% d’acrylamide en condition dénaturante. 1 : marqueur de poids moléculaire 2 : éluât du pull-down

SPR (fig.V.2.). La constante de dissociation Kd entre les deux protéines qui est d’environ 5.10-10 M. Seule la sous-unité B qui a été détectée par pull-down, mais en SPR la sous-unité B seule n’interagit pas avec PAB0955, la topoisomérase VI doit être entière pour interagir avec notre GTPase, suggérant une possible dégradation de la sous-unité A au moment de l’élution.

Figure.V.2. Courbe de SPR entre la topoisomérase VI et PAB0955 à différentes concentrations.

La protéine DnaG n’étant pas disponible, elle n’a pas pu être testée par SPR.

V.1.3. Le rôle de ces partenaires

Les topoisomérases sont des enzymes qui régulent le niveau de surenroulement des molécules d’ADN. Pour altérer le nombre de liaisons de l’ADN, ces enzymes doivent d’abord casser l’un des deux brins ou les deux à la fois. Cette cassure est réalisée grâce à un résidu tyrosine

- 20 0 0 20 0 40 0 60 0 80 0 10 00 12 00 - 2 0 4 0 100 160 220 280 340 400 Temps (secondes) D I F F D E R E S O N A N C E 100 nM 50 nM 25nM 12.5 nM 6.25 nM

de la topoisomérase qui attaque un phosphate du squelette de l’ADN, provoquant une liaison covalente (phosphotyrosine) temporaire entre l’enzyme et l’ADN. Il existe deux classes de topoisomérases, type I et type II. Les topoisomérases de type I cassent un brin d’ADN. Les topoisomérases de type II nécessitent l’hydrolyse de l’ATP pour casser l’ADN double brin, et transféraient un autre segment de double brin à travers la cassure. Ces enzymes sont présentes dans tous les processus impliquant l’ADN et sont essentielles pour la fin de la réplication (Champoux, 2001).

Les topoisomérase de type II peuvent être divisées en deux classes : les IIA et les IIB (Bergerat et al., 1997). Les topoisomérase de type IIA sont les plus nombreuses, elles se retrouvent dans certains bactériophages, virus et archaea ainsi que chez tous les eucaryotes et toutes les bactéries. Elles sont homologues en séquence, mais leur organisation oligomérique peut varier. Les topoisomérase de type IIA organisent leur fonction catalytique de façon modulaire, avec un domaine ATPase situé dans la région B (en Nter), les activités de liaison et

de cassure de l’ADN sont situées sur la région A (en Cter) (Corbett and Berger, 2003). Les

topoisomérases de type IIB sont moins nombreuses que celles de type IIA, la topoisomérase VI est la seule représentante de cette famille (Champoux, 2001). Cette topoisomérase VI a été identifié chez les archaea et existe également chez les plantes (Hartung and Puchta, 2001).

La topoisomérase VI utilisée pour les expériences de SPR est celle de Sulfolobus shibatae, c'est un hétérotrétramère composé de deux sous-unités A (de 45 kDa chacune) et de deux sous-unités B (de 60k Da chacune). La sous-unité B porte la fonction de fixation et d’hydrolyse de l’ATP. L’hydrolyse de l’ATP induit un changement conformationnel des sous- unités A qui sont liées avec les B. Les sous-unités A interagissent alors avec l’ADN, et leur résidu tyrosine se retrouve bien placé pour permettre la cassure du double brin d’ADN (fig.V.3.). La sous-unité A contient un domaine toprim (topoisomérase-primase) requis pour le clivage de l’ADN (Aravind et al., 1998). Ce domaine toprim contient une centaine de résidus avec deux motifs conservés, un central avec un glutamate conservé et un autre avec deux aspartates conservés (DXD).

Figure.V.3. issue de l’article de K.D. Corbett and J.M.Berger (Corbett and Berger, 2003) En jaune sous-unité B, en rouge, bleu et vert les sous-unités A

V.1.3.2. La DnaG primase

La primase initie la réplication de l’ADN par la synthèse des amorces d’oligonucléotides nécessaire à l’élongation de l’ADN par la polymérase. Chez les archaea, l’homologue de la DnaG primase bactérienne contient le domaine toprim très conservés dans les deux règnes, mais le domaine impliqué dans la fixation de l’ADN n’est pas identifié. La fonction cellulaire des DnaG-like protéines chez les archaea n’a pas encore été clairement identifiée. Seule la DnaG-like de Sulfolobus solfataricus a été retrouvée associée à l’exosome, qui est la machinerie de dégradation de l’ARN. Chez les bactéries, les DnaG-primases sont impliquées dans la réplication de l’ADN. Nous ne pouvons pas exclure que chez les archaea ces protéines jouent également un rôle au niveau de l’ADN.

Le résultat de l’interaction entre la topoisomérase VI et la DnaG primase, impliquées dans la réplication de l’ADN, et PAB0955, est en accord avec notre hypothèse de départ basée sur le contexte génomique de PAB0955. En effet comme indiqué dans l’introduction nous nous sommes intéressés à cette GTPase car son contexte génomique nous laisse supposer qu’elle est impliquée dans la réplication de l’ADN et/ou la division cellulaire. Cette hypothèse est en accord avec le résultat de l’expérience de pull-down.

Nous avons identifié une interaction avec ces deux protéines, mais pour l’instant l’implication au niveau fonctionnel reste inconnue.

Afin de poursuivre la recherche de partenaires de PAB0955, et comprendre sa fonction biologique, nous avons testé par SPR la possible interaction de notre GTPase avec des protéines connues pour être impliquées dans la réplication de l’ADN.