Analyse structurale des mutants D36A et D36N

Les protéines mutées sur l’aspartate 36 n’hydrolysent plus le GTP, ce qui nous a permis d’obtenir la structure des deux mutants D36A et D36N avec GTP.

La structure du mutant D36A avec du GTP (D36A-GTP)

Le C$ de l’alanine 36 est situé au même endroit que celui de l’aspartate 36 dans la protéine sauvage. La position du phosphate-# dans la structure du mutant D36A en complexe avec du GTP (saumon) est proche de celle observée dans la structure GTPEDTA (cyan) de la protéine sauvage (fig.IV.7.a.). Les groupements phosphates dans la structure du mutant sont moins enfouit, et montrent un décalage de 1 Å (flèche) avec ceux de la structure GTPEDTA de la protéine sauvage. Ce déplacement des groupements phosphates est accompagné par celui des motifs G1, G2 et G3 (fig.IV.7.a.).

Ces mouvements concertés permettent de conserver les distances entre les différents motifs et le phosphate-# entre les deux structures (fig.IV.7.b.).

Motifs Liaison GTPEDTA D36A-GTP

Motif G1 G10 NH ---- P# GTP 3.6 Å 3.7 Å Motif G2 G104 C$ ---- P# GTP 4.3 Å 4.3 Å Motif G3 D36 C$ --- P# GTP 7.5 Å 7.2 Å

Figure.IV.7.b. Tableau récapitulatif des liaisons conservées entre les structures GTPEDTA _de la protéine sauvage (cyan) et de la structure GTP du mutant D36A (rose).

Figure.IV.7.a. Superposition de la structure GTPEDTA de la protéine sauvage (cyan) et de la structure GTP du mutant D36A (saumon).

G1

G2 G3

GTP

Le motif GPN est plus éloigné de 1.2 Å dans la structure du mutant D36A- GTP que dans celle GTPEDTA de la protéine sauvage, laissant ainsi plus de place au phosphate-#, qui est plus exposé au solvant. L’absence de magnésium dû à la mutation de l’aspartique 36 en alanine, provoque une situation comparable à celle observée dans la structure de GTPEDTA. Il n’y a pas d’hydrolyse du GTP. De plus l’absence de l’acide aspartique change les interactions avec l’asparagine 67 de la boucle GPN qui recule (fig.IV.7.c.) par rapport au site nucléotidique.

La structure du mutant D36N avec du GTP (D36N-GTP) La position du phosphate-# est

surprenante dans la structure du mutant D36N complexée avec du GTP. Elle est intermédiaire entre celle observée dans les structures de la protéine sauvage GTPEDTA et GTP#S, avec une distance de presque 2Å entre les phosphates-# (fig.IV.8.a.). La P- loop ne suit pas le déplacement du phosphate-# dans le mutant D36N. Le motif G1 du mutant D36N a la même conformation que celui de la structure GTPEDTA.

Figure.IV.7.c. Superposition de la structure GTPEDTA de la protéine sauvage (cyan) et de la structure GTP du mutant D36A (saumon).

N67B

D36

A36

Figure.IV.8.a. Superposition des structures GTPEDTA _{(cyan) et GTP}

!S (rose) de la protéine sauvage et de la structure GTP du mutant D36N (orange). G1 GTP!S GTPEDTA D36N-GTP N36

De ce fait la glycine 10 engage une liaison avec un des oxygènes du phosphate-% (2.88 Å) au lieu de faire une liaison avec le phosphate-# trop éloigné (5.33 Å). Le motif G3 ne suit pas non plus le déplacement du phosphate-#. La distance entre le C$ de la glycine 104 et le phosphate-# est de 4.7 Å. Le motif GPN lui se rapproche de 1 Å et en ferme le site nucléotidique par une liaison

entre l’Asn67B et l’Asn36A. De plus, l’azote ND2 de la chaîne latérale de l’asparagine 36

(acide aminé muté) forme une liaison hydrogène avec un oxygène du phosphate-#, comme la fait l’asparagine 67 (fig.IV.8.c.).

La distance entre le NH de la glycine 10 de la P-loop et l’atome d’oxygène liant les groupements phosphates % et # est de 3.8 Å. Cette distance est proche de celle observée dans la structure GTPEDTA de la protéine native. Comme nous l’avons indiqué dans le paragraphe III.1.5. sur le mécanisme enzy matiq

ue, cette

liaison pourrait déclencher l’hydrolyse du GTP. La position du GTP dans le mutant D36N nous montre peut-être une conformation possible du GTP. Cette position peut également montrer le chemin pris par le phosphate-# après hydrolyse du GTP, avec les acides aminés impliqués dans sa stabilisation, comme l’asparagine 67. Entre les structures D36N-GTP et D36A-GTP, la présence de l’asparagine (N36) provoque de nouvelles liaisons fermant le site nucléotidique et attire le phosphate-#, ce qu’il lui donne une position moins enfouie.

Figure.IV.8.b. Structure du mutant D36N en complexe avec du GTP.

G10

G104

Figure.IV.8.c. Superposition de la structure GTPEDTA (cyan) de la protéine sauvage et de la structure GTP du mutant D36N (orange).

N67B

D36A N36A

Figure.IV.8.d. Superposition des structures des mutants D36A (saumon) et D36N (orange) en complexe avec du GTP.

P# P%

La structure du mutant D36A avec du GDP (D36A-GDP)

La comparaison de la structure D36A en complexe avec du GDP par rapport à celle de la protéine sauvage avec MgGDP montre que les phosphates sont moins enfouis dans le mutant que dans la sauvage. Il y a un décalage de 1 Å (flèche) entre les phosphates-% de ces deux structures.

Les groupements phosphates du mutant D36A se superposent avec ceux du GTP de la structure GTPEDTA. Le motif G3 ne se déplace pas entre les structures D36A-GDP et MgGDP. Par conséquent la distance entre le C$ de la glycine 104 et le phosphate-% varie donc de 5.55 Å à 6.48 Å dans la structure D36A-GDP (décalage de 1 Å) (fig.IV.9). Le motif G2 contenant la mutation reste dans la même conformation que dans la protéine sauvage en complexe avec MgGDP. Les motifs G1, G4 et G5 du mutant D36A suivent le mouvement de recul du GDP par rapport au site nucléotidique.

La structure du mutant D36A-GDP montre qu’en absence de magnésium les groupements phosphates ne sont pas enfouis comme ils le sont dans la structure MgGDP de la protéine sauvage. Dans le paragraphe sur les différentes étapes du mécanisme enzymatique (III.1.5.), nous avons émis l’hypothèse d’un mouvement du nucléotide au cours de l’hydrolyse. La position du GDP, dans le mutant D36A, reflète peut-être ce qu’il se produit après l’hydrolyse du GTP. Lorsque le magnésium se retire du site, une fois le GTP hydrolysé, le GDP reculerait pour sortit également du site.

Figure.IV.9. Superposition des structures MgGDP de la protéine sauvage (bleue) et GDP du mutant D36A (saumon).

G104 MgGDP