Le traitement des données cristallographiques

Lors de l’enregistrement des clichés de diffraction d’un cristal nous observons sur le détecteur des « taches de diffraction » : il s’agit des pixels du détecteur qui ont été excités par des rayons diffractés. Le nombre de photons reçus par l’ensemble des pixels formant la tache permet de déterminer l’intensité de cette dernière.

À chaque tache de diffraction est attribué un indice hkl décrivant la direction de l’onde diffractée (indexation). Ensuite, l’amplitude de cette onde est mesurée à partir des intensités Ihkl (intégration).

II.1.2.1. Indexation des taches de diffraction

Le principe de l’indexation consiste à rechercher une maille et sa matrice d’orientation permettant d’attribuer à chaque tache de diffraction, repérée sur le détecteur, des coordonnées entières. Ces coordonnées sont les indices hkl des taches de diffraction. La détermination de la maille permet de sélectionner les groupes d’espace compatibles avec la géométrie de la maille.

!(x,y,z) : la densité électronique

V : le volume de la maille directe Fhkl : le facteur de structure de la réflexion hkl

F

= "F

" e

#

II.1.2.2. Intégration des intensités mesurées

La position de chaque tache étant connue grâce à la maille et la matrice d’orientation, nous pouvons déterminer l’intensité de ces taches. Pour cela, il existe deux façons de procéder : soit par sommation du contenu des pixels après soustraction du bruit de fond, soit par superposition d’un profil d’intégration (profile fitting), méthode que nous avons choisie. Deux logiciels étaient disponibles au laboratoire pour traiter les données cristallographiques : le programme MOSFLM développé par A. Leslie (Leslie, 1991) et le programme XDS développé par W. Kabsch (Kabsch, 1993). Ils diffèrent par leur façon de calculer les profils de taches.

Le programme MOSFLM calcule un profil en deux dimensions des taches de diffraction, méthode optimale lorsque la mosaïcité est de l’ordre ou inférieur au pas d’oscillation (voir après les facteurs de qualité). Un des avantages de MOSFLM est qu’il possède une interface graphique permettant de bien suivre le déroulement du traitement de données.

Le programme XDS au contraire est une sorte de « boîte noire », qui calcule un profil tridimensionnel des taches de diffraction, permettant une meilleure intégration dans le cas de cristaux mosaïque (lorsque la mosaïcité est supérieure ou égale au pas d’oscillation). Dans la plupart des cas les deux programmes donnent des résultats similaires. L’ensemble de nos jeux de données ont été traités avec le programme XDS.

II.1.2.3. Mise à l’échelle

Dans le cas d’un système parfait, les réflexions équivalentes par symétrie doivent avoir la même intensité. Plusieurs paramètres font que les réflexions équivalentes n’ont pas la même intensité. Par exemple, au fur et à mesure de l’enregistrement de données, le cristal subit des dégradations dues aux rayons X, qui diminuent l’intensité des taches diffractées. Des intensités différentes peuvent également être provoquées par la variation d’intensité du rayonnement synchrotron. Lors d’enregistrement de jeux de données à l’E.S.R.F., les réflexions équivalentes ne vont pas recevoir exactement la même intensité de rayons X, leurs taches de diffraction n’auront donc pas les mêmes intensités. Il est donc important de mettre les données à l’échelle afin de minimiser globalement l’écart entre les intensités des réflexions équivalentes par symétrie. Après mise à l’échelle, les intensités moyennes peuvent être calculées à partir des mesures d’intensités des taches équivalentes par symétrie.

II.1.2.4. Quelques facteurs de qualité

Au cours du traitement des clichés de diffraction, les programmes utilisés donnent différents facteurs statistiques permettant de contrôler la qualité de diffraction du cristal.

La résolution

Selon la résolution du jeu de données, nous aurons une structure plus ou moins détaillée à l’échelle atomique. Plus la résolution est haute plus la structure obtenue est précise. La résolution dépend de la qualité du cristal et de la configuration de l’expérience. La limite de résolution généralement utilisée est celle pour laquelle le rapport signal sur bruit est supérieur ou égal à 2 dans la dernière coquille de résolution.

Le rapport signal sur bruit : I/$(I)

Plus le signal est élevé par rapport au bruit de fond, meilleures sont les estimations des intensités et donc des facteurs de structure. Ce facteur rend compte de la précision des mesures et permet de déterminer le seuil de coupure en résolution d’un jeu de données.

Le facteur Rsym (Rmerge lorsqu’il y a plusieurs cristaux)

Le Rsym représente le désaccord entre les intensités des réflexions équivalentes par symétrie.

Plus il est bas, meilleur est l’accord. Classiquement, au-dessus de 10% pour la valeur globale du facteur Rsym, la qualité des données est discutable. Dans la dernière coquille de résolution,

nous nous sommes limités à un facteur Rsym d’une valeur maximale de 40%.

! Rsym = Ihkl i " < Ihkl> i=1,nhkl

#

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Si un jeu de données est indexé dans le mauvais groupe d’espace, les opérateurs de symétrie appliqués ne sont pas les bons, le facteur Rsym augmente très sensiblement car les réflexions

considérées comme équivalentes par symétrie ne le sont pas. Au cours de l’enregistrement, lorsque le cristal se dégrade, l’intensité diffractée diminue et la valeur du facteur le Rsym

augmente.

hkl : les indices de la réflexion hkl Ihkl : l’intensité de la réflexion hkl

La mosaïcité

Le cristal de protéine n’est pas un édifice cristallin parfait ; il faut plutôt le considérer comme l’association de plusieurs petits blocs cristallins légèrement désorientés les uns par rapport aux autres. La mosaïcité représente la différence moyenne, exprimée en degré, qui existe entre les différents blocs. Plus la mosaïcité est grande, plus la tache de diffraction est étalée sur le détecteur (x, y) et apparaît sur un domaine étendu en % (angle d’oscillation) et, en conséquence plus le signal recueillit par chaque pixel est faible. La mosaïcité provient de différentes origines. Au cours de la croissance cristalline, les molécules constituant le cristal peut ne pas s’empiler comme elle le devraient. Au moment de la congélation des cristaux, les tensions subies peuvent également augmenter la mosaïcité. Lorsque la mosaïcité est trop élevée, les taches de diffraction peuvent s’élargir au point de se superposer avec leur voisine, empêchant alors une estimation correcte de leur intensité.

La complétude

La complétude est le rapport entre le nombre de réflexions uniques effectivement mesurées et le nombre théorique de réflexions uniques qui pourraient être mesurées à une résolution donnée. Ce facteur, exprimé en pourcentage, doit être le plus élevé possible, typiquement au- dessus de 90%.

La redondance

La redondance est le nombre de fois où l’intensité d’une réflexion unique est mesurée. Plus une réflexion est mesurée un grand nombre de fois, meilleure sera l’estimation de son intensité moyenne I, plus petite sera celle de son écart type $(I) et donc meilleure sera la qualité du jeu de données.