I.1.1. Expression et purification de PAB0955
La protéine codée par le gène PAB0955 de Pyrococcus abyssi a été produite et purifiée par nos collaborateurs de l’équipe de Jean Armengaud du CEA de Marcoule. La présence de codons rares chez Pyrococcus abyssi a nécessité l’utilisation de la souche Rosetta(DE3)pLys qui contient des gènes codant pour des ARNt supplémentaires pour les acides aminés arginine, isoleucine, proline et leucine. La première étape de purification se fait par chauffage de l’extrait cellulaire à 80°C, car la majorité des protéines d’Escherichia coli sont dénaturées alors que les protéines de Pyrococcus abyssi qui est une archaea hyperthermophile résistant à des hautes températures (environ 100°C). Puis, la protéine PAB0955 est purifiée sur une colonne d’affinité grâce à son étiquette constituée de 14 acides aminés dont six histidines, située en Nter. Notre protéine ayant un point isoélectrique théorique de 5.6, la dernière étape
de purification se fait sur une colonne échangeuse d’anion (Resource-Q). La purification permet d’obtenir 6,6 mg de protéine recombinante pure par litre de culture. La protéine est ensuite analysée par spectrométrie de masse et par séquençage Nter. Ceci a confirmé que
c’était bien la protéine PAB0955 recombinante qui a été purifiée, avec une masse moléculaire attendue de 30298 Da au vue de sa séquence primaire (fig.I.1.).
MRGSHHHHHH GMASMIVVFV GTAGSGKTTL TGEFGRYLED NYKVAYVNLD TGVKELPYEP SIDVREFVTV EEIMREGYGP NGAIVESYDR LMEKFNEYLN KILRLEKEND YVLIDTPGQM ETFLFHEFGV RLMENLPYPL VVYISDPEIL KKPNDYCFVR FFALLIDLRL GATTIPALNK VDLLSEEEKE RHRKYFEDID YLTARLKLDP SMQGLMAYKM CSMMTEVLPP VRVLYLSAKT REGFEDLETL AYEHYCTCGD LT
Figure.I.1. Séquence de PAB0955 recombinante
Surligné en vert l’étiquette 6 histidines, surligné en jaune le motif de Walker de type A qui fixe les groupements phosphates du nucléotide.
I.1.2. Degré d’oligomérisation de PAB0955
La protéine recombinante PAB0955 contient 262 acides aminés. Lors de mon arrivée au laboratoire, différents états d’oligomérisation (fig.I.2.) avaient été révélés par une analyse de chromatographie d’exclusion. Les différents états d’oligomérisation (30% de dimère, 50% de tétramère et 20% d’octamère) sont dus aux deux cystéines situées en Cter de la protéine qui
forment un pont disulfure inter-chaîne. Une étude par électrophorèse sur gel d’acrylamide en conditions dénaturantes, a permis de constater que cette oligomérisation était réversible par ajout de DTT (fig.I.3.). En présence de DTT la protéine est homogène, sa masse correspond à celle d’un dimère. Les tests de cristallisation qui suivent ont tous étaient réalisés en présence de DTT afin de conserver une solution protéique homogène monodisperse.
Figure.I.2. Profil d’élution de PAB0955 par chromatographie d’exclusion.
Figure.I.2. En bleu la fraction FP041 ne contient pas de DTT, il y a plusieurs multimères (8X : octamère, 4X : tétramère, 2X dimère). En rouge la fraction Fp040 qui contient du DTT, la protéine est sous forme dimérique exclusivement. Figure.I.3. Gel d’électrophorèse à 12.5% d’acrylamide en condition native. L’ajout de DTT permet d’obtenir majoritairement la forme dimérique.
Figure.I.3. Gel d’électrophorèse natif
Sans DTT Avec DTT
I.1.3. Activité GTPase de PAB0955
La protéine PAB0955 possède un motif de Walker de type A en Nter (7GTAGSGKT14),
permettant la fixation et l’hydrolyse de nucléotide tri-phosphate (fig.I.1.). L’activité hydrolase de PAB0955 a donc été testée en solution montrant que PAB0955 est une GTPase. Ces tests d’activité ont été réalisés à la température optimale de croissance de Pyrococcus abyssi (82°C).
Des quantités croissantes de protéines (0.2 à 1µM) sont incubées avec une quantité fixe de GTP (200µM) dans un tampon EPPS à 50mM à pH 7 avec du MgCl2 à 5mM. Le tampon
EPPS ne varie pas de pH à haute température. L’ensemble protéine et GTP à 80°C est analysé à différents temps (0, 5, 10, 15, 30 et 60 min) grâce à la séparation des différents nucléotides. L’hydrophobicité du GTP (substrat) est différente de celle du GDP (produit) cela permet de les séparer (colonne C18).
À cette température, optimale pour l’archaea, l’activité spécifique d’hydrolyse du GTP de PAB0955 est de 0,012 µmol de GTP hydrolysé en GDP par minute et par milligramme de protéine. Cette vitesse d’hydrolyse est plus faible que celle d’une protéine de type kinase (de l’ordre du µmol), 10 fois plus rapide que celle d’une petite protéine G sans GAP (Sauvage et al., 1991).
L’activité GTPase de la protéine XAB1, homologue humain de PAB0955, a été observée par auto-radiographie sur gel (Nitta et al., 2000). Après 30 minutes, le GTP est hydrolysé partiellement par XAB1, environ 30 à 40% d’après l’intensité des bandes sur le gel. Les conditions expérimentales pour mesurer l’activité d’hydrolyse de XAB1 utilisent 10 fois moins de substrat que d’enzyme. Au contraire nous avons utilisé 100 fois plus de substrat que de protéine pour mesurer l’activité d’hydrolyse de PAB0955. Il est donc difficile de comparer leur activité à la nôtre, mais dans les deux cas, la vitesse d’hydrolyse n’est pas comparable à celle d’une kinase.
I.1.4. Repliement de PAB0955
Avant d’entreprendre des tests de cristallisation, il est important de savoir si la protéine étudiée est repliée ; c’est-à-dire si elle adopte des structures secondaires de type hélice-! ou brin-". Les protéines présentant des parties non repliées ou trop flexibles pour adopter toujours la même conformation ont peu de chance de cristalliser. Sur le serveur ExPASy
(http://www.expasy.org/tools/#secondary) il est possible de faire une prédiction de structure secondaire. Notre protéine devrait, selon la prédiction, présenter une alternance de brins-" et d’hélices-!. Sachant que les GTPases adoptent un repliement de type Rossmann, ceci est en accord avec la prédiction de structure secondaire.
Nos collaborateurs du CEA de Marcoule ont analysé la solution de protéine pure par dichroïsme circulaire. Cette technique permet de connaître la proportion d’hélices-!, de brins- " et de parties non structurées dans une protéine. Le dichroïsme circulaire repose sur le fait que les protéines sont des structures optiquement actives qui n’absorbent pas de la même façon la lumière polarisée circulairement à droite et à gauche. De cette analyse, ils ont pu confirmer que la protéine était repliée ; et qu’elle adoptait une structure avec environ 50% en hélice-! et 50% en brin-".
Une fois la protéine purifiée, elle nous est envoyée congelée. C’est pourquoi nous avons tout d’abord vérifié que le transport et la congélation n’avaient pas affecté son repliement. Pour cela, nous avons utilisé la résonance magnétique nucléaire à une dimension, pour savoir si la protéine était correctement repliée et pour tester sa thermostabilité. Les spectres ont montré que la protéine était repliée, et qu’elle le restait en augmentant la température (jusqu’à 48°C). Elle est donc bien thermostable. La propriété de thermostabilité vient du fait que Pyrococcus abyssi est une archaea hyperthermophile. La conservation de cette propriété nous indique que la protéine n’a pas été altérée au cours du transport ou par la congélation.
La protéine recombinante PAB0955 est donc pure, homogène en solution, dimérique, thermostable, elle présente des structures secondaires et possède une activité d’hydrolyse spécifique pour le GTP.