Propriétés physiques

Dans la plupart des applications spectroscopiques en biologie, le but est l'étude des compositions chimiques et des structures biologiques des échantillons analysés. La diversité des spectres enregistrés en

2.2. Biosignaux 41 plusieurs points de l'échantillon facilite la détermination des constituants chimiques en recherchant par exemple des points où seulement une espèce est présente. Les structures biologiques sont physiquement délimitées et l'enregistrement de spectres en diérents points de l'échantillon peut faire ressortir cette structure. C'est pourquoi la notion de surface d'acquisition est toujours implicitement liée à ces applica-tions. Le recours à l'imagerie spectrale semble donc naturel. Mais l'acquisition des spectres par imagerie se matérialise sous la forme d'un cube de donnéesX dont chaque dimension correspond au déplacementx selon la longueur de l'échantillon, au déplacementyselon la largeur de l'échantillon, et au nombre d'onde ν de la vibration mise en jeu en spectroscopie Raman (voir section 1.4.1.2, page 29) ou à la longueur d'onde λde la transition électronique considérée en spectroscopie de uorescence (voir section 1.4.1.1, page 27). Ce cube de donnéesX se dénit par :

X ={XxyΛ|1≤x≤Nx, 1≤y≤Ny, 1≤Λ≤NΛ}

oùNx,NyetNΛsont respectivement les nombres de spectres acquis selon les dimensionsx,yet le nombre de longueurs d'ondeλ, pour la spectroscopie de uorescence, ou le nombre de nombres d'onde¯λ, pour la spectroscopie Raman, enregistré pour chaque spectre. La grandeurΛreprésente le nombre d'ondeλ¯ou la longueur d'ondeλselon que la spectroscopie considérée est Raman ou de uorescence. Comme en chaque point de mesure nous voulons identier uniquement la présence et la concentration d'un composant, nous n'avons pas besoin de relation spatiale entre les diérents points de mesure. Le cube de donnéesX peut être déplié. Il peut s'écrire sous une forme plus attractive en concaténant toutes les lignes du cube les unes à la suite des autres.

N_x N_y

N

N

N_y

N_x

Fig. 2.1 Représentation schématique du déploiement d'un cube de données sous forme d'une matrice La gure 2.1 présente cette opération de manière schématique. Il en découle une représentation des données sous forme d'une matrice X. La dimension i de cette matrice représente une combinaison li-néaire des dimensions x et y, et l'autre dimension reste le Λ. Cette matrice X s'exprime sous forme mathématique :

X={xiΛ|1≤i≤Nxy, 1≤Λ≤NΛ} (2.1) oùxiΛ=XxyΛ,i=x+Nx(y−1)et Nxy=NxNy.

Fig. 2.2 Exemple d'un cube de donnéesX en imagerie spectrale de uorescence :xreprésente la position en µm selon la longueur de l'échan-tillon, y la position en µm suivant la largeur et λla longueur d'onde ennm

Fig. 2.3 Le déploiement du cube X en une matrice de données en imagerie spectrale de uo-rescence : iest l'indice de concaténation etΛ la longueur d'onde ennmde l'équation (2.1)

Un exemple de cube de donnéesX est fournit sur la gure 2.2 lors de l'enregistrement de spectres de uorescence à la surface d'un grain de blé pour des points de mesure respectant un quadrillage suivant la longueur et la largeur de l'échantillon. Le remaniement du cube X sous la forme d'une matrice de donnéesXest représenté sur la gure 2.3. C'est sous cette forme que tous les cubes de données utilisés dans ce mémoire seront agencés.

Spectres Raman : Les lois physiques régissant la spectroscopie Raman sont connues comme étant linéaires. Il a été observé dans de nombreux travaux [88, 129] qu'en un pointide l'échantillon à analyser le spectre mesuré xi résulte de la superposition pondérée par les coecients aij des spectres Raman des espèces chimiques pures sj constituant cet échantillon, ce qui est déni mathématiquement par : xi = P_p

j=1aijsj, où pest le nombre d'espèces chimiques pures constituant l'échantillon. La gure 2.4 illustre cette stratication théorique des spectres enregistrés pour un échantillon virtuel de peau paranée sur support de uorine. Par virtuel, nous entendons qu'à des ns illustratives, le spectre d'un échantillon de peau proposé sur la gure 2.4 n'est rien d'autre que la somme pondérée des trois spectres de référence de la peau, de la parane et du support en uorine. Pour une mesure eectuée en un autre point de l'échantillon, le spectre résultant sera vraisemblablement diérent car les espèces chimiques constitutives de l'échantillon sont présentes en des proportions diérentes d'un point de mesure à un autre. Pour une longueur d'onde donnée et pour une espèce chimique donnée, l'intensité du rayonnement diusé sera directement proportionnelle à la concentration de cette espèce [88], et ceci reste valable pour toutes les

2.2. Biosignaux 43 longueurs d'onde et pour toutes les espèces présentes. Ainsi les concentrations des espèces chimiques, qui sont indépendantes du nombre d'onde, sont traduites par les intensités des spectres enregistrés.

Une autre propriété physique des spectres Raman découle de la nature des signaux manipulés. La spectroscopie optique est basée sur des phénomènes radiatifs mettant en jeu les transitions vibrationnelles d'une molécule (voir section 1.2.2.3, page 14). Ces transitions n'étant pas continues, les photons diusés par l'échantillon possèdent des énergies discrètes caractérisées par leur nombre d'onde. L'appareillage de réception et d'enregistrement est calibré pour éviter tout décalage en fréquence et toute distorsion des signaux réceptionnés. Les spectres acquis sont donc instantanés en nombre d'onde.

Spectres de uorescence : En spectroscopie de uorescence, une relation de linéarité existe entre l'intensité du spectre d'une molécule et sa concentration [16]. Les spectres d'excitation et d'émission mesurés sur un échantillon sont supposés être le résultat de la superposition pondérée des spectres des espèces chimiques constitutives de l'échantillon [95]. Les coecients de pondération restent les concentra-tions relatives de ces espèces. De plus, pour un raisonnement semblable à celui de la spectroscopie Raman mais reposant cette fois sur le phénomène d'émission de lumière par un corps, les spectres enregistrés sont également supposés instantanés mais en longueur d'onde cette fois ci.

Modélisation commune : En conclusion, les spectroscopies Raman et de uorescence fournissent des spectres qui suivent un modèle linéaire et instantané, à savoir que les spectres des espèces en présence dans le mélange s'additionnent, le spectre de chaque espèce étant pondéré par un coecient proportionnel à la concentration de cette espèce. Par abus de langage, dans toute la suite de ce mémoire, les coecients de pondération seront dénommés comme les concentrations des espèces. Ce modèle linéaire et instantané s'écrit sous la forme d'un produit matriciel :

X=AS. (2.2)

oùX= [x1, . . . ,xi, . . . ,xNxy]^T ∈ R^Nxy×NΛ est la matrice des données spectrales acquises sur l'échan-tillon, avec xi = [xi1, . . . , xiΛ, . . . , xiNΛ]^T ∈ R^NΛ le spectre enregistré au point de mesure i, et xiΛ

l'acquisition enΛ(la longueur d'onde pour la spectroscopie de uorescence ou au nombre d'onde pour la spectroscopie Raman) au point de mesurei.S= [s1, . . . ,sj, . . . ,sp]^T ∈ R^p×NΛest la matrice des spectres despespèces chimiques de base (ou espèces pures), avecsj = [sj1, . . . , sjΛ, . . . , sjNΛ]^T ∈ R^NΛ le spectre pure de l'espèce chimiquej, ets_jΛ l'intensité du spectre purejenΛ.A= [a₁, . . . ,a_j, . . . ,a_p] ∈ R^Nxy×p est la matrice des concentrations des espèces pures, avec aj = [a1j, . . . , aij, . . . , aNxyj]^T ∈ R^Nxy le prol de concentration dans l'échantillon de l'espèce chimique purej, etaij la concentration de l'espèce chimiquejau point de mesurei. L'opérateur^T dénit l'opération de transposition d'un vecteur ou d'une matrice.

Fig. 2.4 Décomposition d'un spectre virtuel de peau en fonction de ses constituants. À gauche et de haut en bas : spectre de référence de la parane, spectre de référence du support de uorine, spectre de référence du collagène. À droite : spectre résultant d'une somme pondérée des trois spectres précédents

2.3. Traitements des spectres de uorescence 45