2.3 Traitements des spectres de uorescence
2.3.4 Prétraitements
Les spectres acquis par spectroscopie de uorescence résultent d'une acquisition complexe. Certains phénomènes, tels que des uctuations ou des dérives de la chaîne d'acquisition, peuvent masquer l'infor-mation liée à la uorescence de l'échantillon et apparaissent comme gênants dans diverses applications.
Des prétraitements sont appliqués aux jeux de données pour améliorer la forme des spectres et faciliter l'utilisation ultérieure d'analyses multidimensionnelles. Ces prétraitements, devenus classiques en spec-troscopie de uorescence et exposés dans la suite, sont l'élimination du courant noir, la correction de la réponse spectrale du système, l'élimination de la diusion Raman et la normalisation des spectres.
2.3.4.1 Élimination du courant noir
Comme nous l'avons décrit dans le chapitre précédent, le courant noir9 est le courant mesuré sur les détecteurs CCD dans une obscurité totale, en l'abscence de laser excitateur et d'échantillon. L'intensité de ce bruit est dépendante de la température du CCD mais également du temps d'exposition des pixels.
Pour s'aranchir de ce courant, un spectre scf ∈ RNΛ est enregistré à vide grâce au CCD, c'est à dire qu'aucune lumière n'est dispersée sur le détecteur. Ce spectre du courant noir est simplement soustrait au spectrexi enregistré en chaque point de mesureide l'échantillon à analyser [23] :
xi=xi−scf, i= 1, . . . , Nxy.
2.3.4.2 Correction de la réponse spectrale non uniforme du spectromètre
L'ecacité du détecteur CCD ainsi que la transmission et/ou la réexion de la lumière par les éléments optiques du monochromateur d'émission dépendent de la longueur d'onde du rayonnement émis. An de rendre les mesures indépendantes de l'appareillage, et ainsi uniquement dépendantes de la structure mo-léculaire de l'échantillon analysé, cette réponse de l'instrumentation doit être corrigée. Les fabriquants de spectromètres de uorescence fournissent dans la documentation de l'appareil des coecients correcteurs qui doivent être appliqués sur les spectres de uorescence mesurés an de corriger la réponse spectrale non uniforme du spectromètre [38]. Une autre méthode consiste à enregistrer les spectres de uorescences de sources calibrées. Ces spectres étant connus, des facteurs de correction de la réponse spectrale du
9dark current en anglais
2.3. Traitements des spectres de uorescence 49 spectromètre, dépendants de la longueur d'onde d'émission, peuvent en être déduits. Ces facteurs sont, comme dans la première méthode, appliqués à chaque spectre mesuré an d'en éliminer la contribution non uniforme du système de détection [82, 23].
2.3.4.3 Élimination de la diusion Raman
Dans certaines applications, si une substance majoritaire est très active en Raman, le rayonnement diusé peut interférer avec le signal de uorescence, voire le masquer complètement. Par exemple, Wentzell et al [136] ont montré que les molécules du solvent (du méthanol dans cette expérience) diusent de manières élastique (diusion Rayleigh) et inélastique (diusion Raman) dans le voisinage de la longueur d'onde excitatrice. Ce phénomène, concurrent de l'émission de uorescence, s'observe dans la matrice d'excitation-émission par une bande diagonale. Un exemple, tiré des travaux de Wentzell [136], est montré sur la gure 2.6. Sur les spectres d'excitation-émission représentés sur la gure 2.6 sous forme de courbes d'équi-intensité, une bande diagonale apparaît à partir de la longueur d'onde d'excitation de 360nmet pour des longueurs d'onde d'émission qui lui sont voisines, comme prédit par la théorie des phénomènes radiatifs. Cette zone est entourée par une ellipse rouge sur la gure 2.6.
Fig. 2.6 Pollution d'une matrice d'excitation-émission par la diusion Raman d'un solvant (gures tirées de [136])
Plusieurs statégies existent pour éliminer cette diusion. Premièrement, une solution est oerte en soustrayant de la matrice d'excitation-émission le fond de diusion Raman enregistré à partir d'un échan-tillon de la matière diusante seule [136]. Cependant, les coecients de soustractions doivent être mi-nutieusement estimés an de ne laisser aucun résidu, et le spectre enregistré de la matière diusante doit être exactement identique à la partie polluante de la matrice d'excitation-émission. Les conditions d'acquisition de ce spectre et de la matrice doivent être rigoureusement les mêmes.
La deuxième méthode consiste simplement à écarter, de l'analyse multidimensionnelle qui va suivre, les portions de la matrice d'excitation-émission aectées par le spectre Raman de la molécule diusante.
Nous éliminons donc les zones de la matrice où longueur d'onde d'excitation et longueur d'onde d'émission
sont approximativement identiques. Mais, dans certaines applications, cette méthode a l'inconvénient de réduire fortement l'information disponible pour l'analyse multidimensionnelle .
Une troisième méthode non-supervisée a été développée dans [136]. Les matrices d'excitation-émission enregistrées sont concaténées selon l'une des deux dimensions an de former une matrice uniqueX. Une Analyse en Composantes Principales (ACP) est utilisée pour décomposer cette matrice. Les composantes relatives à la diusion Raman sont écartées, et seules les composantes signicatives sont conservées. Sous forme mathématique, cette décomposition s'écrit :
X=Xsignal+Xbruit
oùXsignalest le sous-espace signal obtenu par ACP etXbruitle sous-espace bruit composé de l'inuence Raman. La matrice est reconstruite à partir des composantes principales retenues et dénissant le sous-espaceXsignal. L'inuence du spectre Raman de l'espèce diusante a maintenant disparue. Finalement, cette matrice est redéployée pour donner les matrices d'excitation-émission originales mais nettoyées de l'eet Raman.
2.3.4.4 Normalisation des spectres
Le prétraitement le plus communément appliqué aux spectres de uorescence est la normalisation des spectres. Dans la plupart des applications de spectroscopie de uorescence nécessitant un traitement numérique des signaux enregistrés, cette opération est réalisée. Cette normalisation a pour eet d'accorder à tous les spectres enregistrés la même importance informative [14], c'est-à-dire de réduire les eets liés à l'intensité lors de l'application de techniques d'analyse multivariée. En eet, lors de l'enregistrement de matrices d'excitation-émission, l'intensité du laser excitateur, et donc l'intensité des rayonnements émis, et l'ecacité de l'optique d'excitation sont dépendantes de la longueur d'onde excitatrice. Une normalisation de la matrice d'excitation-émission corrige cette dépendance à la longueur d'onde excitatrice et annule les disparités d'intensité. La priorité est ainsi donnée à la forme des spectres et non à leurs intensités relatives. Plusieurs types de normalisations existent.
Le premier style de normalisation est la réduction de l'aire des spectres de uorescence à l'unité [75], c'est à dire que la transformation suivante est réalisée sur chaque vecteur xi de la matrice des données X:
xi= xi
PNΛ
Λ=1xiΛ
pour i= 1, . . . , Nxy (2.5) avecNΛ le nombre total de longueurs d'onde d'émission dont l'intensité est enregistrée.
La deuxième forme de normalisation est réalisée par rapport à l'intensité maximale de chaque spectre enregistré [101]. Cette transformation se traduit donc sous la forme :
xi = xi
max(xi) pour i= 1, . . . , Nxy. (2.6)
2.3. Traitements des spectres de uorescence 51 Une troisième possibilité consiste à forcer les spectres à un écart type unitaire, c'est à dire à leur appliquer la transformation suivante :
xi= xi
(xTi xi)12 pour i= 1, . . . , Nxy. (2.7) À la suite de ces transformations, les spectres de uorescence sont prêts à être traités par des techniques d'analyses multidimensionnelles qui estimeront les spectres des espèces pures ainsi que leurs prols de concentrations.
Dans la suite de ce mémoire, ces trois types de normalisation seront successivement utilisés en fonction de la méthode de séparation numérique des spectres employée.