Paranage des échantillons biologiques et problèmes liés au déparanage classique 129

An d'être étudiés dans des conditions optimales et reproductibles, les échantillons biologiques doivent répondre à deux exigences majeures :

• Après analyse, les tissus étudiés par des spécialistes ont besoin d'être stockés dans une

biblio-thèque pour des analyses ultérieures. En cancérologie, les échantillons prélevés à un stade précoce de la maladie sur des patients sont stockés dans une tumorothèque an d'être analysés de nom-breuses années plus tard. Des corrélations sont ainsi étudiées entre les propriétés physiques, chi-miques, spectroscopiques, ou autres, de l'échantillon et l'évolution de la maladie chez le patient, à savoir son décés, sa guérison ou une rechute. Les tissus doivent donc posséder une propriété de conservation.

• Les principales techniques d'analyse microscopiques et pathologiques, telles que les méthodes basées sur la spectroscopie Raman et les méthodes histochimiques et immunohistochimiques, s'appliquent sur de nes sections d'échantillon an de transmettre la lumière. Or, la texture de l'échantillon doit être susamment consistante pour permettre une coupe aisée de l'échantillon en tranches nes.

Les échantillons ne répondent pas à ces exigences. Un conditionnement est capable de leur attribuer ces capacités. Il s'agit du paranage qui est un processus d'enveloppement des échantillons dans une couche de parane. La parane étant un excellent conservateur de tissus, la structure des échantillons n'est pas aectée et leur dégradation naturelle est stoppée. Les techniques de paranage d'échantillons biologiques sont parfaitement maîtrisées, simples à mettre en oeuvre et peu onéreuses. Ces avantages ont fait du processus de paranage une méthode très populaire de traitement des échantillons en biologie comme le prouvent ces nombreuses applications [45, 120, 41, 83, 39].

Les méthodes classiques d'analyse microscopiques et pathologiques citées précédemment ne s'ap-pliquent pas sur les échantillons paranés puisque la parane empêche l'accession directe au spécimen à analyser. Un traitement chimique de l'échantillon permet d'éliminer la parane, cette étape s'appelle le déparanage ou le dégraissage. Les méthodes d'élimination les plus utilisées, telles que le xylène, His-toclear, HMAR²¹ et Trilogy, consistent grossièrement au retrait de la parane et à la réhydratation de l'échantillon par trempage dans diérents bains de solvants. Cette pratique est courante pour l'examen de tissues tumoraux issus par exemple du cancer du sein [52] et du cancer de la peau [45].

Une étude menée par Ó Faoláin a conclu à l'existence de trois principaux inconvénients lors de l'uti-lisation de ces méthodes :

• Le processus de déparanage est gourmand en réactifs chimiques et en temps. Plusieurs bains de solvants diérents sont nécessaires pour nettoyer l'échantillon. Par exemple dans [41], l'agent de dégraissage est le xylène. Le protocole est particulièrement compliqué comme indiqué ci-après : les échantillons sont successivement plongés dans deux bains de xylène pendant 5min, puis 4min, deux bains d'éthanol pendant environ 3 min, puis 2min, et ensuite dans un bain de Industrial Methylated Spirits à 95% pendant 1min. Les échantillons sont nallement plongés dans un bain de xylène durant 18 heures.

Ces méthodes peuvent aussi exiger des conditions expérimentales spéciques, comme la technique HMAR qui impose de fortes températures et pressions aux échantillons.

21Heat-Mediated Antigen Retrieval

4.4. Application de l'ACI à la spectroscopie Raman : le déparanage numérique 131

• Suite aux contacts répétés avec ces substances chimiques agressives et aux conditions expérimen-tales éprouvantes, la structure des échantillons peut être altérée. Ces méthodes vont à l'encontre même de l'objectif du paranage, c'est-à-dire conserver l'intégrité des échantillons au cours du temps et des diérentes analyses.

• Les méthodes de dégraissage les plus populaires ne sont pas aussi ecaces que leur succès le sous-entend. Une couche résiduelle de parane perdure après l'étape de déparanage en certaines parties du tissus [41] et la présence de la parane peut fausser l'analyse du tissu.

Le développement d'une méthode ecace de dégraissage des échantillons paranés doit réaliser les opérations suivantes :

• Elle doit être rapide et simple à mettre en oeuvre.

• Elle ne doit pas altérer la structure biologique de l'échantillon à analyser.

• Le déparanage de l'échantillon doit être total.

4.4.2 Vers un déparanage numérique

Nous proposons maintenant de développer une procédure numérique de déparanage d'échantillons biologiques. Une méthode numérique peut possèder les deux premiers avantages recherchés, à savoir être rapide et simple, et ne pas dégrader l'échantillon. La dernière propriété énoncée et recherchée dépend quant à elle de l'ecacité de la méthode choisie. Le déparanage sera complet si la technique numérique est appropriée au modèle des données à analyser.

Le traitement du signal numérique agit sur des objets numériques. Une méthode d'analyse indirecte de l'échantillon parané est donc nécessaire pour enregistrer des signaux numériques. Par indirecte nous entendons une méthode d'analyse qui s'applique sur l'échantillon parané. Ainsi, l'établissement d'une procédure numérique de déparanage repose sur le choix d'une méthode d'analyse capable de sonder un échantillon parané, et le choix d'un algorithme de traitement numérique des signaux enregistrés par la méthode d'analyse. Il est évident que le choix de la méthode d'analyse dictera partiellement le choix de la méthode de traitement numérique.

Les méthodes spectroscopiques allient l'analyse moléculaire non-destructive des échantillons, la forte sensibilité aux espèces chimiques présentes dans l'échantillon et la rapidité d'investigation. La spectro-scopie Raman a été retenue pour sonder les échantillons aux vues de ses nombreux avantages sur les autres méthodes spectroscopiques décrits au paragraphe 1.3.2.3 à la page 23. Les pics Raman sont in-tenses et étroits en nombres d'onde. L'identication des bandes spectrales caractéristiques des diérents constituants de l'échantillon sera facilitée.

La sensibilité de la spectroscopie Raman est duale lors de l'analyse d'un échantillon biologique paraf-né. Elle assure la détection de la présence de l'échantillon biologique situé sous la couche de parane.

Mais la spectroscopie Raman est aussi très sensible à la présence de parane qui s'exprime sous forme de

400 600 800 1000 1200 1400 1600

Fig. 4.1 Spectre Raman de la parane seule

400 600 800 1000 1200 1400 1600 0

Fig. 4.2 Spectre Raman de la uorine seule

pics étroits et intenses, présentés sur la gure 4.1, qui masquent l'information vibrationnelle importante de l'échantillon sous-jacent. C'est cet eet de masque qui a jusqu'à maintenant empêché l'utilisation de la spectroscopie Raman sur des échantillons paranés. La seule étude menée avec succès sur des échantillons non chimiquement déparanés a été réalisée par Tfayli [126]. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier a été utilisée avec succès pour la discrimination entre des nævi et des mélanomes sur des échantillons de peau paranés. Cette étude a été réalisée sans traitement numérique des spectres puisque la parane ne contribue pas aux bandes spectrales caractéristiques de la peau.

La parane n'est pas la seule espèce parasite des spectres Raman enregistrés sur un échantillon.

L'acquisition des spectres n'est possible que si l'échantillon est xé sur un support d'analyse comme expliqué au paragraphe 1.4.1.2 à la page 29. Ce support est choisi de façon à avoir l'activité Raman la plus faible et situé dans des bandes spectrales inactivées par l'échantillon analysé. Dans la suite de cette section, un support de uorine, dont le spectre est présenté sur la gure 4.2, a été sélectionné.

Sans traitement adapté des spectres Raman enregistrés en diérents points de l'échantillon biologique, il est impossible d'extraire les informations pertinentes reliées à l'échantillon situé sous la parane. Un spectre acquis sur un tissu parané de peau humaine positionné sur un support en uorine est visible sur la gure 4.3(a). Le pic labellisé par∗et centré à325cm⁻¹est caractéristique de la uorine. Les pics de la parane sont repérés par les signes + et sont centrés à 890 cm⁻¹, 1063cm⁻¹, 1133 cm⁻¹, 1172 cm⁻¹,1296cm⁻¹,1372cm⁻¹,1418cm⁻¹,1441cm⁻¹et1463cm⁻¹. Sur ce spectre, il apparaît clairement que les pics caractéristiques de la peau, symbolisés par le signe# et situés à 1002cm⁻¹ et 1660 cm⁻¹, sont négligeables devant les pics de la parane et de la uorine. Les autres informations sont totalement noyées dans le spectre et sont représentées par une estimation par ACI du spectre de la peau sur la gure 4.3(b). Une analyse visuelle s'avère donc limitée devant la faible intensité Raman de la peau.

Au lieu d'utiliser une méthode traditionnelle et inecace de dégraissage des échantillons paranés, l'étude des propriétés physiques et statistiques des spectres Raman va nous guider vers la désignation

4.4. Application de l'ACI à la spectroscopie Raman : le déparanage numérique 133

400 600 800 1000 1200 1400 1600 0

*

+ pics caractéristiques de la paraffine

# pics caractéristiques de la peau

(a)

400 600 800 1000 1200 1400 1600

−1.5

Fig. 4.3 (a) Exemple de spectre Raman enregistré sur un échantillon parané de peau humaine sur support de uorine, (b) Spectre Raman de la peau estimé par ACI

d'une méthode de traitement numérique du signal an d'éliminer la parane et la uorine des spectres Raman enregistrés.