Proposition de loi concernant les abattoirs

4.15.1. Metodologia para avaliação de atividade antioxidante

Os extratos, frações de partição e substâncias puras foram analisados mediante ensaio de redução do radical DPPH (MOREIRA et al., 2005). Os padrões, rutina e quercetina, e a(s) substância(s) isoladas foram dissolvidas em MeOH HPLC, nas concentrações: 33,3; 26,7; 20,0; 13,3; 6,7; 3,3 e 1,7 M. A solução de DPPH foi preparada na concentração de 0,04 g/L, em MeOH grau HPLC. Os extratos e frações de partição foram diluídos em MeOH HPLC, nas concentrações: 0,667; 0,0333; 0,0100; 0,0067; 0,0033; 0,0027 e 0,0017 mg/mL.

A análise foi feita em microplacas transparentes de 96 poços, com capacidade para 300 µL. A primeira fileira foi preenchida com o branco (300 µL de MeOH por poço) e sua leitura foi feita antes da placa contendo as amostras.

As fileiras posteriores foram preenchidas com as 7 diferentes concentrações de extrato e frações (100 µL de extrato por poço), sendo que a última fileira de poços continha apenas MeOH e foi utilizada como controle. Então, foram adicionados 200 µL da solução de DPPH em cada poço. Todas as amostras foram analisadas em triplicata e tiveram seu desvio padrão calculado.

Após a adição da solução de DPPH, cada placa foi deixada na ausência de luz por 30 minutos e, então, leu-se as absorbâncias em leitor de microplacas Synergy-HTS em 517 nm. Os dados obtidos foram então processados empregando a fórmula a seguir, que foi inserida no programa KC4, o qual calculou e gerou os gráficos da atividade seqüestradora de radicais livres.

Processamento dos dados:

Fórmula: % de seqüestro do radical livre estável DPPH %= (abs do CONTROLE-DPPH- abs da AMOSTRA ou PADRÃO)x100

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4.15.2. Metodologia para avaliação de atividade anticolinesterásica

Estes testes foram realizados no Instituto de Botânica de São Paulo, sob a supervisão da Dra. Maria Claúdia Marx Young e Dra. Elaine Monteiro Cardoso Lopes (IB-SMA/SP).

Ensaio qualitativo por autografia (CCD)

Após o desenvolvimento cromatográfico em CCD dos extratos e frações, a placa foi borrifada com a solução da enzima acetilcolinesterase (6,66 U) acrescida de albumina bovina fração V (0,1%) e o solvente evaporado novamente. A placa cromatográfica foi previamente incubada em uma câmara úmida fechada a 37 C por 20 minutos, e em seguida borrifada com uma mistura das soluções: etanólica de 1- naftil acetato (5 mL; 0,25%) e aquosa do sal Fast Blue B (20 mL; 0,25%) (MARSTON et al., 2002). A coloração roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de mancha branca (indicação de inibição da reação enzimática), sobre um fundo de coloração roxa indica que houve inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase. Os cromatogramas obtidos foram observados em  254 e 366 nm e fotografados em câmera fotográfica Epson. Os valores de Rf (fator de retenção) foram calculados onde houve inibição da reação enzimática, ou seja, presença de halos de cor branca indicadores de inibição da acetilcolinesterase. Utilizou-se como controle positivo a galantamina (1 g) dissolvida em metanol.

4.15.3. Metodologia para avaliação de atividade antifúngica

Os ensaios contra fungos fitopatogênicos foram realizados no Instituto de Botânica de São Paulo, sob a supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young (IB- SMA/SP) e contra patógenos humanos foram realizados sob a supervisão da Profa. Dra. Maria José S. M. Gianinni na Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP de Araraquara.

Bioautografia foi obtida com suspensão de esporos de fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (Pemzig) SPC sobre placas de CCD. Após incubação, zonas de inibição claras contra o fundo escuro devido ao crescimento fúngico indicam teste positivo (HOMANS; FUCHS, 1970).

63 A atividade sobre fungos patogênicos humanos foi avaliada frente às leveduras Cândida albicans ATCC 90028, C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, Cryptococcus neoformans ATCC λ0012 em placas com ágar “Hole Plate”, utilizando meio de cultura RPMI1640 adequadamente preparado. No preparo do inoculo: utilizou-se repiques de 24 a 48h a 30 C. Uma alçada da amostra foi resuspendida em 5 mL de solução salina 0,85% e realizou-se contagem em câmara de Neubauer. A suspensão equivalente foi preparada a 1x106 – 5x106 _UFC/mL. Cálculo da suspensão: N = número de células x 2,5 x 1000 x 100 x volume da suspensão. O volume inicial da suspensão a ser inoculada na placa foi de 1 mL e utilizou-se alça para a semeadura em 8 direções. Após a secagem das placas, utilizou-se um furador para perfurar os poços, em seguida aplicou-se 50 L das amostras, diluídas em DMSO. O controle positivo foi a Anfotecina B a 16 mg/mL. Foram incubados a 35 C, durante 24 a 48 hs. Na leitura e interpretação: mediu-se o tamanho dos halos de inibição através da medida total do diâmetro pelo verso da placa (NATIONAL COMMITEE, 1994 e 1997).

4.15.4. Metodologia para avaliação de atividade citotóxica

Os testes de citotoxicidade foram feitos com participação do Prof. MSc Paulo Michel Pinheiro Ferreira, sob supervisão da Dra. Cláudia do Ó Pessoa, no Laboratório de Oncologia Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.

Material

Células: As linhagens utilizadas, MDA-MB/435 (mama - humano), HCT-8 (cólon - humano), SF-295 (glioblastoma - humano) e HL-60 (leucemia - humano) foram cedidas pelo National Cancer Institute (NCI - EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.

Amostras: As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril. Amostras foram testadas em concentração única de 50 µg/mL para extratos e as substâncias puras, em 5 µg/mL.

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Método: A análise de citotoxicidade foi feita pelo método do MTT que foi descrita primeiramente por MOSMAN (1983), tendo a capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas.

As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 106 cél/mL para as linhagens MDA/MB-435 e SF-295 e 0,7 x 105 cél/mL para a linhagem HCT-8. Os compostos foram acrescidos em concentração única de 100 µg/mL (extrato). As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37 C. Ao término deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em seguida, adicionou-se 150 L da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram incubadas por 3 h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 L de DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 590 nm. Das substâncias testadas, somente aquela(s) que demonstra(m) percentual de inibição de crescimento celular acima de 75% em pelo menos duas linhagens, é submetida à avaliação de citotoxicidade frente a linhagens tumorais para determinação da IC50, seguindo a metodologia descrita abaixo.

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços nas seguintes concentrações: MDA/MB-435, SF-295: (0,1 x 106 _{cel/mL); HCT-8: (0,7 x 10}5 _cel/mL) e HL-60: (0,3 x 106 _{cel/mL). A substância previamente diluída em DMSO foi diluída} em série, em meio RPMI para obtenção das concentrações finais [(0,39-100 g/mL/poço (extrato)], cujo volume adicionado foi de 100 L / poço. Após um período de incubação de 72h, as placas foram retiradas e centrifugadas a 1500 rpm / 15 minutos. O sobrenadante foi aspirado e foi adicionado 200 L de solução de MTT 10% em RPMI, sendo a placa colocada na estufa a 5% de CO2 por 3h. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 3000 rpm / 10 minutos, tendo o sobrenadante aspirado e seu precipitado ressuspendido em 150 L de DMSO e agitado por 10 minutos, até completa dissolução dos cristais de formazan. As placas foram lidas no espectrofotômetro da placa a um comprimento de onda de 595 nm.

Análise Estatística: Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão da média (DPM) da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o programa GraphPad Prism.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO